血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定.pdfVIP

血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定 一、实验目的 1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 2. 掌握醋酸纤维素薄膜 电泳法的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 5.学习 层析技术 二、实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不 同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 （一）粗提原理-盐析法 1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度， 或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。 2.水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分 子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。 3.蛋白质表面的 电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子 强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低， 蛋白质分子之间聚集而沉淀。 4. 由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程 度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉 淀从而达到分离的目的。 （二）脱盐原理-凝胶层析 1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必 先脱盐后才能进一 步纯化。 2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分 离的技术。 （三）纯化原理-离子交换层析 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换， 利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 （四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜 电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4 。它们在 pH8.6 的 缓冲液中均解离带负电荷，在 电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分 子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上 电泳的速度也不同。 因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin) 、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、 γ-球蛋白 5 条区带。 三、材料与方法： （一）实验材料 1.样品：人混合血清 2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙 基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的 pH6.5 醋酸铵缓冲 溶液、pH8.6 巴比妥缓冲溶液、氨基黑 10B 染色液、20%磺基水杨酸 溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2 溶液、漂洗液 器材：层析柱、 电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等 （二）实验方法 1.实验步骤 取血清 1.0ml，边摇边缓慢滴加饱和 硫酸铵溶液 0.8ml，混匀室温放置 10min， 4000r/min 离心 10min 盐 沉淀（含球 上清液（含清蛋白、少 析 蛋白） 量 α 加 水 球蛋白和 β 球蛋白） 过葡聚糖凝 过葡聚糖凝 0.6ml 溶解 胶 G-25 胶 G-25 层 析 层析柱（1.0× 用 1ml 用 1ml 0.02mol/L （1.0×7cm）