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PRRSV 与干扰素刺激基因Viperin 、DCP1a 相互作用研究 目 录 摘 要 i Abstract iv 缩略语表（Abbreviation ）viii 第1 章 文献综述 1 1.1 干扰素刺激基因的研究进展 1 1.1.1 干扰素刺激基因概述 1 1.1.2 干扰素刺激基因抗病毒机制 2 1.1.3 病毒拮抗干扰素刺激基因机制 5 1.1.4 DCP1a 的研究进展 6 1.1.5 Viperin 的研究进展 7 1.2 猪繁殖与呼吸综合征 10 1.2.1 PRRSV 概述 10 1.2.2 PRRSV 的分子生物学特征 10 1.2.3 PRRSV nsp1α 的研究进展 12 1.2.4 PRRSV nsp4 的研究进展 12 1.2.5 PRRSV 与ISGs 相关研究进展 14 第2 章 研究目的与意义 16 第3 章 材料与方法 17 3.1 实验材料 17 3.1.1 细胞、毒株与菌株 17 3.1.2 siRNA 干扰分子、质粒及构建相关材料 17 3.1.3 细胞培养及相关试剂 19 3.1.4 细胞转染以及Western blot 相关试剂 20 3.1.5 抗体及间接免疫荧光相关试剂 21 3.1.6 主要实验仪器及设备 21 3.1.7 分子生物学软件 21 3.2 实验方法 22 3.2.1 RNA 提取及cDNA 合成 22 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位论文 3.2.2 真核表达质粒构建22 3.2.3 脂质体介导的瞬时转染25 3.2.4 Western blot 及Co-IP 实验25 3.2.5 实时荧光定量PCR 实验27 3.2.6 间接免疫荧光实验28 3.2.7 病毒的扩增以及病毒滴度测定29 3.2.8 基于CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除细胞系29 3.2.9 双荧光素酶检测实验30 3.2.10 统计学方法30 第4 章 结果与分析31 4.1 猪源Viperin 抑制PRRSV 复制的机制31 4.1.1 pViperin 抑制PRRSV 增殖31 4. 1.2 pViperin 降解病毒的nsp1α 蛋白32 4.1.3 pViperin 通过蛋白酶体途径和细胞凋亡途径降解nsp1α 34 4.1.4 pViperin 靶向nsp1α 的K150 位点进行K29 形式泛素化修饰35 4.1.5 pViperin 靶向nsp1α 的D149 位点进行细胞凋亡途径降解36 4.1.6 pViperin 降解nsp1α 不依赖其SAM 酶活性38 4.2 猪源DCP1a 对PRRSV 的抑制作用以及PRRSV 对猪源DCP1a 拮抗作用40 4.2.1 过表达pDCP1a 微弱抑制PRRSV 增殖40 4.2.2 干扰内源性pDCP1a 促进PRRSV 增殖41 4.2.3 PRRSV 感染切割pDCP1a 43 4.2.4 PRRSV nsp4 切割pDCP1a 依赖其蛋白酶活性44 4.2.5 PRRSV nsp4 切割pDCP1a 的E238 位点45 4.2.6 PRRSV nsp4 切割pDCP1a 致弱了其抗病毒活性46 4.2.7 PRRSV nsp4 不切割mDCP1a 48 第5 章 讨论与结论49 5.1 讨论49 5.1.1 猪源Viperin 抑制PRRSV 复制49 5.1.2 猪源DCP1a 对PRRSV 的抑制作用以及PRRSV 对猪源DCP1a 的拮抗作用..51 5.2 结论53 参考文献54 附 录73 致谢75 II PRRSV 与干扰素刺激基因Viperin 、DCP1a 相互作用研究 摘 要 干扰素刺激基因 （I