LncRNA-MEG3调控猪骨骼肌卫星细胞分化的机制研究.pdfVIP

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2021-01-09 发布于江苏
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LncRNA-MEG3调控猪骨骼肌卫星细胞分化的机制研究.pdf

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LncRNA-MEG3 调控猪骨骼肌卫星细胞分化的机制研究目录摘要 i ABSTRACT iv 缩略词表（ABBREVIATIONS ）viii 1 前言 1 1.1 研究问题的由来 1 1.2 骨骼肌发育研究进展 2 1.2.1 骨骼肌发育的一般过程 2 1.2.2 骨骼肌发育相关基因 3 1.2.3 骨骼肌发育相关通路 7 1.3 长非编码RNA 研究进展 9 1.3.1 lncRNA 的定义及分类 9 1.3.2 lncRNA 调控机制 10 1.4 骨骼肌发育相关lncRNA 研究进展 11 1.5 MEG3 研究进展 13 1.6 研究目的和意义 14 2 材料和方法 15 2.1 技术路线 15 2.2 实验材料 15 2.3 主要仪器设备 15 2.4 主要试剂耗材 16 2.5 实验方法 17 2.5.1 骨骼肌卫星细胞的分离培养 17 2.5.2 RNA 提取及检测 19 2.5.3 反转录成cDNA 19 2.5.4 荧光定量PCR 21 2.5.5 ASO 及siRNA 设计与合成 22 2.5.6 真核表达载体构建 23 2.5.7 细胞转染 23 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位（毕业）论文 2.5.8 5’/3’ RACE 扩增24 2.5.9 细胞核质RNA 分离24 2.5.10 细胞增殖检测25 2.5.11 转录组分析26 2.5.12 蛋白质免疫印迹技术（Western blot ）27 2.5.13 免疫荧光29 2.5.14 载体构建和双荧光素酶报告分析30 2.5.15 RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP ）分析31 2.5.16 生物素化的miRNA pull-down 分析32 2.5.17 染色质免疫沉淀（ChIP ）分析32 3 结果与分析34 3.1 MEG3 基本序列特征及表达规律分析34 3.1.1 MEG3 基本序列获取34 3.1.2 MEG3 的组织表达特征分析35 3.1.3 MEG3 在猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化阶段表达特征分析35 3.1.4 MEG3 的核质分离鉴定37 3.2 MEG3 抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖38 3.2.1 MEG3 干扰和超表达效率检测38 3.2.2 CCK-8 检测MEG3 对细胞增殖力的影响39 3.2.3 EdU 检测MEG3 对DNA 复制活性的影响40 3.2.4 流式细胞术检测MEG3 对细胞生长周期的影响41 3.3 MEG3 促进猪骨骼肌卫星细胞分化42 3.3.1 干扰MEG3 后对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响42 3.3.2 超表达MEG3 后对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响44 3.4 干扰MEG3 后转录组测序（RNA-seq ）分析47 3.4.1 测序数据处理及比对47 3.4.2