褪黑素通过抑制卵泡储备损耗延缓小鼠生殖衰老.pdfVIP

目 录 摘要 i Abstract iii 缩略语表 vi 1 前言 1 1.1 卵巢衰老定义与影响因素 1 1.2 原始卵泡库与早期生长卵泡储备的损耗速率决定卵巢衰老速率. 2 1.2.1 原始卵泡储备（PreOR ）的建立 2 1.2.2 原始卵泡激活的调控 3 1.2.3 早期生长卵泡储备（SOR ）的建立 4 1.2.4 早期生长卵泡发育的调控 4 1.2.5 原始卵泡库与早期生长卵泡库的功能联系及其对卵巢衰老的影响 5 1.3 褪黑素在调控动物生殖衰老中的研究进展 6 1.3.1 褪黑素调控更年期脂质代谢 6 1.3.2 褪黑素调控卵巢衰老研究进展 7 1.4 研究问题的提出 8 2 实验材料和方法 9 2.1 实验动物 9 2.2 主要实验试剂、材料及仪器 9 2.2.1 主要试剂 9 2.2.2 主要抗体 11 2.2.3 主要耗材 11 2.2.4 主要仪器 12 2.2.5 主要生物学软件及网站 13 2.3 常用试剂配制 13 2.3.1 褪黑素注射液 13 2.3.2 PMSG/HCG 注射液 13 2.3.3 透明质酸酶 13 2.3.4 蛋白免疫印迹相关试剂 13 2.3.5 切片相关试剂 14 2.3.6 卵巢体外培养液 14 I 2.4 实验方法 15 2.4.1 实验设计15 2.4.2 样品收取与处理15 2.4.3 RNA 提取与反转录16 2.4.4 qRT-PCR 17 2.4.5 颗粒细胞收集与培养18 2.4.6 高效液相色谱法测褪黑素18 2.4.7 小鼠卵巢分离与体外培养19 2.4.8 切片制作与HE 染色20 2.4.9 免疫组化与免疫荧光20 2.4.10 Tunel 染色22 2.4.11 切片分析23 2.4.12 免疫印迹（WB ）23 2.4.13 超数排卵与配种实验23 2.4.14 Snat 基因敲除鼠构建24 2.4.15 基因敲除鼠基因型鉴定24 2.4.16 发情周期检测25 2.4.17 褪黑素安全性评估26 2.4.18 数据分析方法26 3 实验结果与分析 27 3.1 小鼠初情期前卵泡发育过程中卵巢局部褪黑素变化规律 27 3.1.1 卵泡颗粒细胞表达SNAT 并具备合成褪黑素的能力27 3.1.2 在初情期前卵泡发育过程中卵巢褪黑素水平逐渐减低28 3.2 培养体系中添加褪黑素对原始卵泡激活和早期卵泡生长的影响 29 3.3 体内注射褪黑素对小鼠原始卵泡激活的影响及其作用机制研究 31 3.3.1 体内注射褪黑素抑制原始卵泡激活31 3.3.2 褪黑素通过PI3K-AKT-FOXO3 信号抑制原始卵泡激活32 3.3.3 褪黑素提升卵巢抗氧化能力33 3.4 体内注射褪黑素对早期卵泡生长、闭锁的影响及作用机制研究 34 3.4.1 体内注射褪黑素抑制早期卵泡生长与闭锁34 3.4.2 早期卵泡生长过程中褪黑素处理降低超数排卵数及胚胎附植数35