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表达载体的构建方法及步骤 表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类 , 其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基 因载体。 一个合格质粒的组成要素： 1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 （ 2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+ 3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 4） P/E 启动子 / 增强子 5） Terms 终止信号 6）加 poly （A ）信号可以起到稳定 mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的， 同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。 如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点： 【 1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增 / 基因表达，选择合适的克隆载体 / 表达载体。 【 2】 .载体的类型： （ 1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小 （大选大，小选小）。如10kb 选 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 1） Ampr 水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 2） tetr 可以阻止四环素进入细胞。 3） camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （ 4） neor （kanr ）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418 （长那霉素衍生物）失活 （ 5） hygr 使潮霉素 β失活。 第三步：看多克隆位点（ MCS ）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基 因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入， 会导致某种标志基因的 失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效 率越低。 第五步：是否含有表达系统元件， 即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录 终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。 克隆载体中加入一些与表达调控 有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 1）启动子－促进 DNA 转录的 DNA 序列，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 2）增强子 / 沉默子－为真核基因组 （包括真核病毒基因组） 中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。 其作用与增强子所在的位置或方向无关。 即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。 / 沉默子－负增强子，负调控序列。 （ 3）核糖体结合位点 / 起始密码 /SD 序列（ Rbs/AGU/SDs ）： mRNA 有核 糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG （起始密码）和 SD 序列。 4）转录终止序列（终止子） / 翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中 有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down －stream 有一段 GT 或 T 富 丰区，这 2 部分共同构成 poly （ A ）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中 有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down － stream 有一段 GT 或 T 富 丰区，这 2 部分共同构成 poly （ A ）加尾信号。 质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即 质粒是环状双链 DNA ，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一 条链上 . 根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。 二、目的基因的获得 一般来说，目的基因的获得有三种途径： 调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的 cDNA 中通过 PCR 的方法调取目的基因， 链接到克隆载体挑取单克隆进行测序， 以获得想要的基因 片段，这种方法相对成本较低， 但是调取到的基因往往含有突变， 还有不同基因 的表达丰度不同， 转录本比较复杂， 或是基因片段很长， 这些情况都很难调取到 目的基因。 全基因合成：根据目的基因的 DNA 序列，直接设计合成目的基因。此方法准确 性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点 是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列， 同时可以进行密码子优化， 提高 目的基因在宿主内的表达量。 三、克隆构建 目前，克隆构建的方法多种多样， 除了应用广泛的酶切链接以外， 现在还有很多 不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤