实验六SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量(预习报告).docxVIP

生物化学实验预习报告 实验六SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子虽 一、 研究背景 电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的 “差异转换”思路上一次伟大的飞跃，在实 际应用的过程中，人们发现了它在大量样品纯化上的劣势以及分析上的突出优点， 进行“扬 长避短”，最终将其作为生物大分子分离鉴定的常用技术而被保留与发展下来。自电泳技术 发明以来，生命科学领域迅猛发展，人们对生物大分子的研究不能仅仅停留在分离、纯化、 鉴定这些宏观操作上， 需要确定它们的分子量进行更加深入的研究， 所以迫切需要一种新技 术能够测定像蛋白质这样的生物大分子的相对分子质量。 人们又把目光转移到迅猛发展的电 泳技术上来，试着去寻找突破口。 在之前的非变性电泳技术中， 生物大分子得以分离的基础 是基于三方面的差异，即分子质量、 分子大小与形状、电荷性质。 如果要测定种生物大分子 的分子质量，直接测定难度很大，这就需要首先找到一个参照标准（标准蛋白） ，在待测蛋 白与标准蛋白之间进行“差异缩小”，将他们在电场中泳动速度的大小仅仅体现为分子量上 的差异，再通过寻求某种线性关系就能得到蛋白质样品的分子质量。 此外，人为地借助其他 物质处理来缩小这些差异也就意味着破坏蛋白质的原有结构， 变性电泳便成了必然。 这一步 是整个技术的核心，也是最难的突破的。 1967年，Shapiro年首次报告了 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳系统，根据他对 11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基）分子量的对 数与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。 随后，Weber等人进行深入研究，肯定了 Shapiro 的发现，确立了以连续的磷酸盐系统作为电极缓冲系统的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 蛋白质分子量的新方法。后来， Laemmli将SDS电泳和Davis的不连续盘状电泳结合起来， 设计出了不连续的 SDS-Tris-甘氨酸系统。⑴由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、 重复性好、微量、设备简单、价廉和操作容易、迅速等优点，因而得到了迅速的发展和广泛 的应用，目前已成为蛋白质研究的有力工具， 广泛地应用于分子生物学、 生物化学、遗传学、 病理学、微生物学和植物生理学等学科的研究中。 在本次实验中，我们采用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tris-甘氨酸系统）测定蛋白质分 子量，体会学习这一技术的发明历程、原理及操作。 二、 研究目标 体会SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发明历程； 进一步学习和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与方法； 学习和应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 三、 研究策略 同时对蛋白质样品和标准蛋白进行处理，消除他们在形状以及电荷量上的差异，仅剩 下分子量的差异； 将处理后的样品和标准蛋白在相同条件下进行电泳，他们的迁移速度不同，经过一段 时间后，会体现出迁移距离上的差异。 分析相对迁移率和蛋白质分子质量之间的关系，作出图像，计算样品蛋白的相对迁移 率，从图像上直接得出它的分子质量。 四、 研究方案及可行性分析 研究方案 SDS (十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate )是一种很强的阴离子表面活性剂，它 以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合， 形成牢固的带负电荷的 SDS壶白质复合物。SDS 和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为 1.4 : 1 ,由于这种高密度的结合，新引入的净 电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷， 从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有 净电荷的差异，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。 SDS祈白质复合物具有均一的电荷密度、 相同的荷质比。据流体力学等方面的研究推测， SDS-蛋白质复合物呈紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒定的，在 18A的数量级，与 蛋白质的种类无关；棒的长轴是变化的，而且与蛋白质的分子量成正比。这就是说， SDS和 蛋白质结合后所形成的 SDS壶白质复合物，消除了由于天然蛋白质分子形状的不同对电泳 迁移率的影响。 带电分子电泳迁移率的大小取决于三个方面， 即带电荷的多少、分子量的大小和分子的 形状。根据上面的分析，SDS作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使 分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 而强还原剂如疏基乙醇， 二硫苏糖醇能使半胱 氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS后，分子被解聚成多肽链， 解聚后的氨基酸侧链和 SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电 荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS和蛋白质结合后使其电泳迁移 率仅取决于蛋白质分子量的大小， 因而可以通过比较未知分子量的蛋白质和已知分子量的蛋 白质分子的迁移率，测定出未知蛋白质的分子量。 可行性分