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试验长链生物素化小分子的探针 乳腺癌细胞 MCF7 / W ( 美国模式培养物集存库，ATCC) 、乳腺癌多柔比星耐药细胞 MCF7 / ADM为本实验室建株。生物素、6-氨基己酸( 6-aminocap- roic acid) 、N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯( N，N-disuc- cinyl carbonyl carbonate，NHS) 、二环己基碳二亚胺 ( N，N-dicyclohexylcarbodiimide，DCC ) 、4-二甲氨基吡啶( dimethylaminopyridine，DMAP) [阿拉丁试剂( 上海) 有限公司]; 多柔比星( 大连美仑生物技术有限公司) ; 紫杉醇( 江苏红豆杉药业有限公司) ; 链霉亲和素磁珠( 美国 Roche 公司) ; DMEM 高糖培养基( 美国 Gibco 公司) ; 胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) ; 胰岛素( 浙江万邦药业有限公司) ; 核染试剂 DAPI( 碧云天生物) ; 多聚甲醛( 美国Sigma 公司) 。 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞培养 MCF7 / W 细胞和 MCF7 / ADM 细胞均培养于含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素及链霉素的 DMEM 培养基，并补加终浓度为 2 umL - 1 的胰岛素，置于饱和湿度、5% CO2 的 37 ℃ 恒温培养箱培养。细胞传代时以 PBS 洗涤，0. 25% 胰酶消化。 1. 2. 2 生物素化氨基己酸的合成( 图 1) ①N，N-琥珀酰亚胺生物素酯( NHS-biotin) 的合成: 在烧瓶中将2. 45 g( 0. 01 mol) 生物素、3. 10 g( 0. 01 mol) N， N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶解至 37. 5 mL DMF 中， 将烧瓶置于冰水混合物中，缓慢加入 7. 0 mL 三乙胺，室温氮气保护反应 6 h，95 ℃ 减压蒸馏除去多余 DMF 至沉淀尚未析出，加入 6 倍 DMF 体积的异丙醇，冷却至结晶产生，结晶完全后，70 ℃ 减压蒸馏去除瓶内溶液，加入少量 DMF 至结晶重新溶解完全， 再加入 6 倍 DMF 体积的乙醚，冷却至室温待结晶产生，结晶完全后，减压抽滤得到 NHS-biotin( 2) 。②生物素-氨基己酸的合成: 将 5 mL 水、5 mL 二氧环己烷、0. 325 g 6-氨基己酸加入烧瓶，将烧瓶放入冰水混合物中，用 NaOH 溶液调节 pH 至 8. 5，加入 0. 85 g NHS-biotin，室温反应 24 h，加入 10 mL 乙醚，不断搅拌至完全结晶，减压抽滤，将得到固体结晶转移至干净的 25 mL 烧瓶中，加入 5 mL 丙酮，HCl 溶液调节 pH 至 3. 0，减压抽滤，将得到的白色固体产物用甲醇洗涤，每次 1 mL，洗 3 次，40 ℃ 置于真空干燥箱过夜，得到生物素化氨基己酸( 3) 。 1. 2. 3 生物素化 DOX 的合成( 图 2 ) 将 0. 047 g ( 0. 000 1 mol) biotin-氨基己酸溶解于 10 mL DMF ( 二甲基甲酸胺) 至完全后，加入 25. 33 mg DCC、 1. 53 mg DMAP，然后加入 0. 075 g( 0. 000 1 mol) 多柔比星固体粉末，室温避光反应 36 h，薄层色谱( TLC) 监测反应终点。减压蒸馏去除溶液后，加入少量的乙醚，待结晶完全后，减压抽滤，将所得的红色固体产物置于 40 ℃ 干燥箱真空干燥过夜，得到粉末状深红色粉末，即为生物素化 DOX( 4) ，4 ℃ 避光保存 1. 2. 4 生物素化 PTX 的合成( 图 3 ) 将 0. 144 g ( 0. 000 4 mol) 生物素氨基己酸溶于 40 mL DMF， 充分溶解，再加入 0. 1 g DCC，冰水浴稳定 0. 5 h;将 0. 34 g( 0. 000 4 mol) PTX，7 mg DMAP 溶于适量 DMF 中后再缓缓加入上述反应体系，室温反应24 h，减压蒸馏得固体产物，层析色谱分离得到目标产物( 白色粉末) ，即为生物素化 PTX( 5 ) ，放于真空干燥箱 40 ℃ 干燥过夜，取出称重。 1. 2. 5 高效液相色谱条件确认 仪器: Waters 48 h，每孔加入 10 L Cell Titer Blue 培养 1 ～ 4 h，取出 96 孔板，于酶标仪上读取荧光( excitation = 560 nm; emission = 590 nm) 值。 1. 2. 8 激光共聚焦分析 将细胞接种至玻底培养皿生长过夜; 吸去培养基，PBS 洗涤 3 次; 加入 200