雷公藤跨膜转运蛋白TwMATE2、TwMATE3克隆与表达分析.pdfVIP

摘 要 摘 要 雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f. ）是一种重要的天然药物资源，从雷公藤植 株提取分离所得到的倍半萜生物碱具有良好的医药和农用活性，经济价值大。但雷公 藤次生代谢物含量低，提取分离困难，化学合成方法成本高难度大，严重制约着雷公 藤植物资源的开发利用。利用代谢工程对植物代谢途径进行调控是提高次生代谢物产 量的方法之一。MATE （Multidrug and Toxic compound Extrusion ）蛋白是一类重要的跨 膜转运蛋白，参与次生代谢物质转运等过程，因此我们对与次生代谢物转运相关的 MATE 转运蛋白基因进行克隆、定位与功能研究，为了解雷公藤倍半萜生物碱的跨膜 转运原理、提高活性物质含量及简化后续分离操作奠定基础。目前所得研究结果如下： 1.克隆了2 个雷公藤MATE 蛋白基因，TwMATE2 开放阅读框 1473 bp，编码490 个氨基酸；TwMATE3 开放阅读框为1518 bp，编码505 个氨基酸。生物信息学分析表 明TwMATE2 蛋白分子量约为53.9 kDa ；TwMATE3 的蛋白分子质量54.5 kDa ，均为不 稳定疏水蛋白，二级结构中具有 12 个跨膜螺旋。荧光定量分析TwMATE2 在雷公藤根 和茎中低水平表达，叶片中表达量高；TwMATE3 基因在根中大量表达，茎和叶中则低 水平表达。 2.构建了亚细胞定位载体 pCAMBIA1302-TwMATE2 ，pCAMBIA1302-TwMATE3， 以及红色荧光定位标记pCAMBIA1301-TIP-RFP 表达载体。农杆菌转化后共注射烟草 叶片进行瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜荧光观察发现TwMATE2 、TwMATE3 蛋白 与定位于液泡膜的TIP 蛋白荧光高度重合，结果表明2 个MATE 蛋白均定位于烟草叶 片液泡膜上。 3.构建了真核表达载体pYES2/CT-TwMATE2 和pYES2/CT-TwMATE3，转化到酵母 细胞INVSc1 中并进行半乳糖诱导表达，蛋白鉴定得到TwMATE2 和TwMATE3 蛋白条 带，分子量分别约为53.9 kDa 和54.5 kDa 。底物转运实验结果证明TwMATE2、TwMATE3 蛋白具有转运雷公藤次碱的功能。 4.构建了pCAMBIA130 1-TwMATE2 ，pCAMBIA130 1-TwMATE3 过表达载体，转化 农杆菌ATCC15834 后侵染雷公藤愈伤组织进行诱导，获得转基因发状根，为进一步研 究雷公藤MATE 基因功能奠定基础。 关键词：雷公藤；MATE ；基因克隆；亚细胞定位；酵母表达 I 目 录 目 录 摘 要I ABSTRACT II 第一章 文献综述 1 1.1 雷公藤次生代谢物研究概述 1 1.1.1 雷公藤次生代谢物的主要活性成分 1 1.1.2 雷公藤次生代谢物的生物活性及应用 2 1.2 雷公藤倍半萜生物碱组织培养研究进展 3 1.3 植物跨膜转运蛋白MATE 研究进展 3 1.3.1 MATE 转运蛋白基本结构 4 1.3.2 植物MATE 转运蛋白的生理功能 5 1.4 选题依据与研究内容 9 1.4.1 选题依据 9 1.4.2 研究内容 9 1.4.3 技术路线 9 第二章 材料与方法 11 2.1 试验材料 11 2.1.1 植物材料 11 2.1.2 试验试剂与仪器 11 2.1.3 培养基及溶液配制方法 11 2.2 试验方法 12 2.2.1 Tw