2.4.4.2 PCR大学生物学大学生物学.pdf

聚合酶链式反应（PCR ） LOGO PCR中的DNA聚合酶 Klenow酶 早期采用，该酶不耐热，缺点有： ①温度要求低(37℃) ，受热即失活； ②产物特异性不高； ③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低； ④扩增的最长序列约400bp PCR中的DNA聚合酶 Taq酶 1969年 ，从美国黄石国家公园温泉中的一种湿 热水生细菌 （Thermus aq uaticus YT-1 ）中 分离得到的耐热DNA聚合酶。 需要Mg2+ ，没有3’5’外切修复错配的碱 基 ，校正单核苷酸错配功能。一般出错率为 2×10-4核苷酸/每轮循环。 钱嘉韵 PCR产物的3’端往往带有一个A。 （Alice Chien Chang ） PCR反应条件 92-95℃ ，富含G和C的序列， 引物中G、C含量高、长度长并与 模板完全配对时，应提高温度。温 可适当提高，但过高或时间过 度越高，产物特异性越高。通常 长都会导致酶活性损失 37-55℃、1-2分钟 变性温度和时间 退火温度与时间 温度：72℃ ，接近Taq酶的最适 退火温度与时 25-40个循环，循环过多，非 75℃。 间 时间：过长会导致产物非特异性增 特异性产物大量增加 加。但对低浓度的目的序列，则可 适当增加时间。 延伸温度和时间 循环次数 影响PCR的因素 模板 （1 ）选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚 合酶与引物和模板的结合。 （2 ）不能存在影响DNA聚合酶活性的因素，如EDTA、DNase 等。 （3 ）目的片段或者目的片段相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在， 都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO ，破坏模板的二级 结构。 影响PCR的因素 引物 （1 ）引物与待扩增区域的模板3’端序列互补，长度以15-30bp为宜。 （2 ）引物中的碱基分布是随机的，应尽量避免相同碱基的连续排列。 （3 ）（G+C ）的含量在45-55% ，引物的Tm （Melting Temperature ）值可用公 式计算 （0.9 M NaCl中，长度为10-20 mer以内） ： [Tm=4(G+C)+2(A+T)] ，Tm值高于55℃。上下游引物的Tm值相差小于5℃。 （4 ）避免两引物间的互补，以免形成引物二聚体。 （5 ）引物的3’端DNA序列一定要与模板互补配对，5端可以不配对或多余；引物 必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。 影响PCR的因素 Mg2+ Taq DNA聚合酶的激活剂，浓度不能太低影响酶的活性，浓度太高 会增加非特异性产物。一般用1.5-4.5 mmol/L 的MgCl 终浓度。 2 影响PCR的因素 dNTPs dATP、