精子特异性KSper和CatSper通道的调控机制和功能研究.pdfVIP

摘要 摘 要 离子通道在细胞的正常功能调控中起着举足轻重的作用。现有的研究表明， 哺乳动物的精子中存在两种重要的的离子通道：特异性钾离子通道KSper 和特 异性钙离子通道CatSper 。KSper 主要调节精子的膜电位，进而影响精子上其他 受膜电位调控的离子通道及转运体。CatSper 通道则介导精子胞内钙离子的调 控，而钙离子作为细胞内重要的第二信使，对于精子诸多的生理功能都有着不 可或缺的作用。受惠于小鼠敲除模型的建立，KSper 和CatSper 通道的功能缺失 都会导致雄性小鼠不育。更重要的是，CatSper 相关基因的缺失同样也会导致男 性不育。而KSper 调控的膜电位失常也可能导致严重的生育障碍。因此，KSper 和 CatSper 通道的正常调控对于精子能否顺利完成正常的受精过程具有十分重 要的作用。 随着精子膜片钳技术的广泛应用，KSper 和CatSper 的调控机制已得到较好 阐明。研究表明，胞内pH 的增加可以显著激活KSper 和CatSper 通道。这就意 味着，精子在由附睾进入雌性生殖道，并游向卵细胞的过程中，能够通过感应 逐渐碱化的胞外环境，引起膜上KSper 和 CatSper 通道的激活，从而诱导后续 一系列重要的生理功能，最终完成与卵细胞的受精。多种 pH 调控机制，例如 + + 钠氢交换器（Na /H exchangers, NHEs ）和电压依赖的质子通道 （voltage-dependent proton channel, Hv1 ），均被证实参与介导精子的胞内碱化， 但这些分子机制是否与 CatSper 和KSper 的激活存在功能偶联仍有待揭示。针 对上述问题，我们通过膜片钳技术和精子功能的相关实验，利用NHEs 和Hv1 的抑制剂，得到了以下的结果：1）NHEs 的广谱抑制剂DMA 能够导致小鼠精 子的胞内酸化，进而显著抑制mKSper 和mCatSper 通道的开放，最终影响小鼠 精子运动及顶体反应的发生。2 ）NHE1 及 NHE5 的抑制剂 cariporide 无法对 mCatSper 产生任何抑制效应。因此，尽管目前尚未找到合适的sNHE 抗体来证 实sNHE 对mKSper 和mCatSper 的调控，但我们仍然推测sNHE 的生理活性是 小鼠精子mKSper 和mCatSper 通道碱性激活的重要保障。3 ）NHEs 与Hv1 共 同参与调控人精子KSper 和 CatSper 的碱性激活效应。相比于Hv1 ，NHEs 对 hCatSper 的调控更为明显，因而，DMA 还会部分影响人精子的胞内钙信号及其 I 摘要 运动能力。 除了pH 敏感的特性以外，人精子KSper 通道还受胞内钙离子的调控。有报 道表明，人为使精子胞内钙离子浓度达到50 M 后可以显著激活hKSper 通道。 然而，精子在生理条件下所产生的内钙增加是否足以引起hKSper 的激活仍然缺 少关键性的证据。为了阐明hKSper 受胞内钙离子的生理调控机制，我们检测了 精子在受到生理浓度下的孕酮刺激后所引起的内钙增加对hKSper 的影响。我们 的结果表明，孕酮引起的内钙增加并未影响hKSper 调控的膜电位，而钙离子载 体ionomycin 或人为添加 1 mM 的胞内Ca2+均可使精子膜电位产生一定程度的 超极化效应。而通过对比在胞内有无钙离子螯合剂 BAPTA 时精子膜电位的区 别，我们发现且证实了，同一样本的不同精子的确会因为精子中基底钙离子的 下调而呈现出膜电位的去极化。因此，我们猜测孕酮未能以增加内钙的方式影 响hKSper 通道是由于hKSper 已经被胞内基底的钙离子所激活。为了验证这一 猜想，我们检测了当精子内钙被螯合以后，孕酮对hKSper 的影响。尽管BAPTA 螯合了部分由孕酮引起的内钙增加，但我们仍旧发现了孕酮导致的膜电位超极 化。因此，基于我们上述的实验结果，我们推测维持精子胞内钙信号的水平对 hKSpe