ErbB4促进抑制性突触和中间神经元周围网络基质形成的机制研究.pdfVIP

摘要 摘 要 神经元作为神经系统的基础结构和功能单元之一，神经元相互间的信息交流是大 脑行使功能所必需的，按照神经元的作用能够分为兴奋性神经元和抑制性神经元。 在大脑中，锥体神经元和中间神经元是两类最重要的神经元，二者相互协调神经元 的活动和放电对生物体的行为表现至关重要。其中，锥体神经元的神经递质是谷氨 酸，属于兴奋性神经元；而中间神经元则是以γ-氨基丁酸（GABA ）为神经递质 是主要的抑制性信号来源。中间神经元在维持大脑的兴奋性和抑制性平衡 （excitation/inhibition balance ，E/I balance ）中发挥重要作用，而E/I balance 的破坏 被认为是导致如癫痫（Epilepsy ）、精神分裂症（Schizophrenia）以及自闭症 （Autism Spectrum Disorder ）等许多神经精神疾病的主要原因之一。 神经调节蛋白1 （Neuregulin1 ，NRG1 ）及其受体（ErbB4 ）的编码基因已被鉴定 为精神分裂症、双相情感障碍（Bipolar Disorder ）和抑郁症（Major Depressive Disorder ）等精神疾病的易感基因。ErbB4 属于跨膜的酪氨酸激酶受体家族，其胞 外结构域（Extra-cellular domain ，ECD ）与NRG1 结合后，形成二聚体，引起胞内 结构域（Intra-cellular domain ，ICD ）中酪氨酸激酶的自磷酸化而被激活，进而引 发胞内下游信号通路级联响应。 在出生后或成年的大脑中，ErbB4 非常特异性地表 达在抑制性中间神经元，NRG1/ErbB4 信号通路调节成年大脑GABA 能突触传递。 抑制性突触是中间神经元与其他神经元联系的结构基础，在抑制性神经环路的装 配中十分关键。突触形成的细胞和分子机制已被大量研究，很多调节兴奋性突触形 成的细胞黏附分子也已经被发现和证实，然而对于抑制性突触形成的分子机制却并 不明确。有研究表明，中间神经元中的ErbB4 对于锥体神经元上 GABA 能突触的 形成和维持具有促进作用，但其中是否需要ErbB4 的激酶活性仍不清楚。 为此，我们首先在体外通过人工突触形成实验（artificial synapse formation assay ）， 将HEK293T 细胞（人胚胎肾293T 细胞）与原代海马神经元共培养，利用免疫细胞 化学染色观察 HEK293T 中过表达的蛋白对神经元中抑制性突触后标志物 gephyrin 聚集的诱导，从而反映锥体神经元上抑制性突触的形成。我们发现表达 ErbB4 的 HEK293T 细胞能够诱导gephyrin 聚集的形成，但表达ErbB4-K751M （ErbB4 第751 位赖氨酸突变为甲硫氨酸，导致 ErbB4 酪氨酸激酶活性失活）突变体的 HEK293T 细胞也能够诱导 gephyrin 聚集，提示ErbB4 诱导锥体神经元上 GABA 能突触的形 成并不依赖 ErbB4 酪氨酸激酶活性。为了在体内证实，我们构建了 ErbB4-K751M 基因敲入（knockin ）小鼠。对比对照野生型（WT ）小鼠，中间神经元的数量以及 ii 摘要 锥体神经元上抑制性突触的数目在 K751M 小鼠脑中均不发生改变，但在ErbB4 缺 陷（Null ）小鼠中都明显减少。接下来，为了探索 ErbB4 如何调节锥体神经元的 GABA 能突触的形成，我们在体外HEK293T 细胞中利用细胞聚集（cell aggregation assay ）和免疫共沉淀实验，发现ErbB4 通过其ECD 中的RLD 结构域与抑制性突触 后跨膜粘附分子 Slitrk3 结合，并且是一种反式（in trans ）跨细胞间的结合。在人 工突触形成实验中，HEK293T 细胞表达ErbB4 缺失RLD 结构域的突变体无法诱导 gephyrin 聚集；进一步在原代神经元中过表达可分泌的 RLD 结构域破坏 ErbB4- Slitrk3 结合后，gephyrin 聚集减少。最后，我们在体外表达纯化RLD 结构域，并利 用立体定位注射至K751M 小鼠海马，以及电生理检测发现抑制ErbB4 与Sl