基于四种信号传导体系的快速检测新方法学研究.pdfVIP

摘要 摘 要 为应对食品安全、饮用水污染及病原体感染等全球公共卫生事件，开发具 有高灵敏、高准确性的快速检测方法，对于有效控制全球公共卫生风险具有重 要的现实意义。基于辣根过氧化物酶（HRP ）催化3，3，5，5- 四甲基联苯胺（TMB ） 显色的ELISA 方法因具有特异性好，检测通量高，价格便宜等优势，已成为食 品安全相关污染物快速、高通量筛选的首选方案。然而，传统以HRP 催化TMB 显色的快检方法，存在酶催化产物颜色单一、产物信号强度不高（TMB 摩尔消 光系数3.9 × 104 M− 1 cm− 1 ）、检测灵敏度偏低、无法实现裸眼检测等缺陷；此外， 传统ELISA 的免疫学反应大多基于半固相界面，存在反应效率不高、需要反复 加样及洗板等操作过程，检测步骤相对繁琐。因此，如何提高快检方法的检测 灵敏度，构建适合现场使用的新策略，成为当前亟需解决的问题。本研究拟以 有机小分子化合物黄曲霉毒素（AFB ）、三磷酸腺苷（ATP ）及无机钠离子（Na+ ） 1 等为模式分析物，从提升样本前处理效率，优化信号输出灵敏度及构建均相快 检体系的角度，建立了基于四种信号传导体系的快检新方法。 在食品安全快检体系中，高效的前处理方法是保障后续检测方法成功及灵 敏度的重要前提。磁性免疫亲和提取方法因具有操作简单、免疫动力学反应效 率高、可用于复杂样本的直接提取等优点，被广泛用于各类样本中目标物的高 效富集与净化。然而，传统的磁免疫亲和分离方法存在磁性微球（MB ）上抗体 载量低，抗体不可重复使用造成的制造成本过高等缺陷。针对以上问题，本研 究通过在MB 表面修饰聚丙烯羧酸分子刷（MB@PAA ），并进一步装载抗AFB1 纳米抗体（anti-AFB1 Nb ），以此建立了一种新型的磁免疫亲和提取玉米样品中 AFB1 的新方法。在该方法中，首先通过可逆断裂链加成聚合方法在羟基化磁性 微球（HMB ）上连接大量聚丙烯羧酸分子刷，以此提高抗体的载量，达到提高 免疫磁珠对AFB1 的饱和吸附量；其次，以耐变性能力更强的Nb 代替传统易变 性的单克隆或多克隆抗体（mAb/pAb ），以提高免疫磁珠的重复使用次数，降低 亲和纯化的使用成本。结果表明，在最佳条件下，MB@PAA 对anti-AFB1 Nb 的 最大饱和偶联量为623 ± 23 μg mg-1，是传统羧基化磁性微球（CMB ）的19 倍； MB@PAA@Nb 对AFB1 的最大饱和吸附量为0.23 mg g-1，是传统MB@Nb 的35 倍。MB@PAA@Nb 在重复富集提取AFB1 10 次后，其对AFB1 的识别活性未见 显著降低（p ＞ 0.05 ），表明MB@PAA@Nb 的重复使用性能较好。此外，该免 II 摘要 疫磁珠使用的可靠性和实用性进一步通过提取 AFB1 加标的玉米样品得到了验 证。 其次，为克服以TMB 为代表的传统酶催化产物显色信号颜色单一、不适宜 于裸眼检测的缺陷。本研究通过引入对pH 敏感的有机染料溴钾酚紫（BCP ）作 为信号输出元件，以 AFB 标记的葡萄糖氧化酶偶联物（GOx-AFB ）作为竞争 1 1 抗原，通过GOx 催化底物葡萄糖产酸介导溶液pH 变化，建立了高灵敏直接竞 争ELISA 定量及定性检测玉米样品中的AFB 。在最优条件下，该方法裸眼定性 1 检测AFB1 的阻断值 （检测限）为100 pg mL-1，在对70 份AFB1 加标的实际玉 米样本裸眼检测中，无假阳性和假阴性结果，证明了该方法裸眼定性检测的可 靠性。该方法定量检测AFB1 线性范围为25 - 200 pg mL-1，半数抑制浓度（IC50 ） 为66.72 pg mL-1，较常规ELISA 提高10 倍。加标实验结果表明，该方法具有较 好的准确度、精密度以及重现性；特异性实验结果显示该方法与赭曲霉毒