实验二培养基的配制和灭菌.docVIP

实验二培养基的配制和灭菌 一、实验目的 微生物的生长发冇都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发冇提供 所需营养的基质。培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的 配制和火菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过木次实验学习植病实验室中常用培养基 的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。 二、内容、材料和方法 （一）培养基的配制 培养基按组成成分及对这些成分了解的稈度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养 基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法 也有差异，限于时间，木次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白豚培养基。 1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA） 这是植病实验室最常用的培养基（简称PSA）,主要用于植物病原真菌的分离和培养，有 时也用于植物病原细菌。 成分：马铃薯200克 蔗糖10?20克 琼脂17?20克 加水至1000毫升 方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水丸沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加 入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化麻，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。 马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH,培养细菌则调节pH至屮性, 此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pHo 5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其屮200毫升分装试管，每管约10毫 升,灭菌后摆成斜面;其余300毫升,分装在3个250—300毫升的三角瓶中,每瓶装100 毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。 2肉汁豚培养基（BPA） 这种培养基主要用于细菌的分离和培养 成分：牛肉浸膏3克 蛋白腺5?10克 蔗糖10克 酵母浸膏1克 琼脂17?20克 加水至1000毫升 方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至 7,趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。 牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要 先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅屮。 调节培养基pH至屮性的方法如下：配成1N的HC1和NaOH,并另分别稀释配成1/20 N的HC1和NaOHo取培养基2亳升，加蒸馆水7.5毫升，加指示剂漠百里酚蓝指示剂5滴, 这时如培养基的测样呈黄色则川有刻度吸管加入1/20 N的NaOH若呈蓝色则加入1/20 N的 HCI,使培养基最后呈草绿色即调节到屮性，此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000 毫升培养基中所需要加入IN的NaOH或HC1的毫升数(注意这次是作500毫升培养基)，加 熬馆水稀释的目的防止调节过程中培养基凝固。 调节pH至屮性的简便方法是用石蕊示纸。也可以用多孔白色瓷板，在孔屮加少量培养 基和漠百里酚蓝或其它指示剂1—2滴，根据颜色反应，在所配的培养液屮加入少量1N的 NaOH或HC1,然后再取样测定，如此反复多次，达到所需求的反应为1上。 5人分为一组，3、4两组备作此培养基500亳升，其中200亳升分装试管，每管约100 毫升，灭菌示摆成斜面，其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶屮，每瓶装100 毫升左右，灭菌后妥善存放，留待下次实验使用。 此外，1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。 (二)培养基的灭菌 为了得到某种病原物的纯培养，配好的培养基必须经过灭菌才能使用，灭菌是指用物理 或化学方法完全杀死器物表血及其内部的所有微生物，火菌与消毒的概念不同，消毒则是指 消灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌)，而不是消灭所有的微生物。 灭菌的方法很多，植病实验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法，一般培养川I、 吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸汽灭菌法进 行灭菌，具体灭菌方法和步骤如下： 1干热灭菌法 ⑴将培养1111、吸管等玻璃器1111洗净干燥示，用IH报纸包好，或装入特制的铁筒屮(每个 吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端，以便取用时手 勿触及要求灭菌的一端。 将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱屮，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。 关紧箱门，打开排气孔接上电源。 待箱内空气排岀到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，用定温固定 温度，灭菌温度一般165°C—175°C保持1小时即可。 待白然降温冷却后(60°C以下)才能开门取出玻璃器1111,避免由于温度突然下降而引起 玻璃器1111碎裂。 2高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到灭菌的目 的，其操作步骤如下： 关好排水阀门放入清水至标度为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。 将要