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实验二生物样品的荧光观察 一、 实验冃的 1、 初掌握荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的结构、原理、使用方法及其在细胞生物学研究中的应 用。 2、 掌握生物材料的荧光染色和活体荧光蛋白的观察方法。 3、 了解激光共聚焦的原理。 二、 实验原理 1、 某些物质经短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量除部分转换为热量外，相当 一?部分则以波长较长的光能辐射出來，这种波长长于激发光的町见光称为荧光。细胞内的某些物质经过短 波光照射后，可以发出自发荧光。在生物学研究中，能将发荧光的有机化合物-荧光染料与特定的细胞纽?分 相结合，通过激发后产生的荧光对细胞组分进行定性和定位。 2、 生物样站的荧光观察采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。荧光显微镜以波长较短的光为光源，照 射被检样品，激发被检物品内的荧光物质发出可见的荧光，通过物镜和目镜放大成像。激光共聚焦能微镜 也是来观察样品中荧光分布状况的。激光共聚焦显微镜是以激光为光源，在某一?瞬间只用很小一部分光照 明，通过检测器的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，血来自焦平面外的散光则被 小孔和裂缝扌当住，成像异曲清晰。此外，激光共聚焦显微镜可以在同一样品的不同焦平面进行扫描得到不 同焦平面的图像，然后通过计算机重构出样品的三维结构。 3、 本实验中微丝的荧光观察采用荧光素标记的鬼笔环肽(phalloidin),鬼笔环肽可以专一的结合在聚 合状态的肌动蛋门丝上，起到稳定微丝的作用。细胞核的观察用DAPI(diamidino-2-phenylindole)染色。DAPI 能与DNA双螺旋的凹槽部分相互作用，从『U与DNAXZ链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰358nm, 而散射峰是461nm0而植物细胞的花粉管、筛板和胞间连丝含有脐U氐质成分，经苯胺蓝染色后，用紫外光 激发，可以发出黄绿色荧光。 4、 激光共聚焦扫描显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)原理：用激光作扫描光源，逐 点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点， 也是瞬时成像的物点。山于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大 约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的-个平血内。调焦深度不一样时，就可 以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞 样品的立体结构。 三、 实验材料、试剂和仪器 1、 材料：烟草悬浮细胞、拟南芥、蚕豆 2、 试剂：3.6%多聚甲醛、Pipes 缓冲液、lOOnm Alexa Fluo488 phalloidin^ DAPI 染色液、0.1%苯胺蓝 3、 仪器：Olympus荧光显微镜、恒温培养箱、移液器、载玻片、盖玻片、锻子 四、 实验内容 荧光标记观察烟草悬浮细胞微丝骨架的分布 1、烟草悬浮细胞继代培养。 MS培养基的基本成分： MS 无机盐+KH2P04200mg/L；烟酸 10mg/L;维生素 Bllmg/L； 肌醇 100mg/L； 2, 4-D O.lmg/L；蔗糖 30g/L 在室温、黑暗生长，120~130rpm 2、固定：収300山细胞液放入离心管中，静置沉降，3000rpm离心30 s,吸出培养基，加入500^13.6% 多聚甲醛，固定20mino再吸出固定液，用Pipes缓冲液清洗三次，每次5min° 3 染色:3000rpm 离心 lmin,吸净缓冲液,加入 lOOnrn Alexa Fluo488 phalloidin 50pl, 37C染色 20min, 洗去染色液，加入50山缓冲液，吸取10山直接进行封片。 4、荧光显微镜观察：在蓝光激发下进行观察，检测的发射光波长为510-530nmo （二） DAPI染色检测细胞核DNA 用银子夹住三朵不同发育时期的拟南芥的花,将花粉黏在载玻片上，加入20UIDAPI染色液染色3-5min, 在紫外激发下用荧光显微镜观察，检测发射光为461nmo （三） 、苯胺蓝染色观察胞间连丝 撕取蚕豆叶片下表皮，用20Pl 0.1%苯胺蓝染色3-5min后紫外激发下镜检。 五、实验结果 （一）荧光标记观察烟草悬浮细胞微丝骨架的分布 图1烟草悬浮细胞微丝骨架形态（phalloidin标记，Olympus荧光显微镜，40X物镜） 荧光显微镜下可以观察到，烟草悬浮细胞呈现岀不规则形状，原因是培养之前去除了细胞壁。再培养 —段时间后细胞壁再生，会有不同的形态。细胞中有一条绿色的丝状结构，即为微丝，细胞和附近颜色较 深。微丝在细胞内呈现三维空间分布，细胞核附近分布较多，经查阅相关文献，解释为微丝在细胞内起到 固定位置的作用。 （二）