Mn2+浓度对地衣芽孢杆菌产不同构型γ-聚谷氨酸机理分析.pdf

摘要 摘 要 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）是能够高效发酵合成聚-γ-谷氨酸的生产菌， 不同Mn2+浓度可以影响地衣芽孢杆菌产聚-γ-谷氨酸的构型。目前关于该菌产不同构型 的γ-聚-D-PGA （γ-D-PGA ）机理方面的研究还不是很透彻。围绕三个L-谷氨酸和D-谷 氨酸代谢关键酶，分别为谷氨酸消旋酶（GR ）、D-丙氨酸转氨酶（D-DDT ）和谷氨 酰胺合成酶（GS ），以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）KH-2为对照菌株，通过体内 体外酶学性质研究、结合基因转录水平术等功能基因组学分析手段，初步阐明了不同 Mn2+浓度对地衣芽孢杆菌产不同聚-γ-谷氨酸的机理。 本文分析比较了不同Mn2+浓度对B . licheniformis和S. subtilis产聚-γ-谷氨酸的构型 变化。其中对比菌株B. subtilis KH-2 ，在含有不同的Mn2+浓度（0, 0.6, 1.2, 1.8和2.4 mmol/L ）的发酵液中，γ-D-PGA所占的比例稳定（84%-86% ），而不同Mn2+浓度下， B. licheniforms WBL-3 产γ-L-PGA 和γ-D-PGA 的比例明显不同。Mn2+ 浓度为0 时， γ-D-PGA仅占22% ，当Mn2+浓度为0.6 mmol/L时，γ-D-PGA构型所占的比例最高，达到 67%，继续提高Mn2+浓度，发酵液中γ-D-PGA所在的比例出现降低的趋势。 比较两菌三个L-谷氨酸和D-谷氨酸代谢关键酶在Mn2+浓度为0与0.6 mmol/L 的体 外酶学性质。B. subtilis KH-2 中Mn2+并未对三种代谢关键酶起到激活作用，而对于B. licheniformis WBL-3 Mn2+对GR起到一定的促进作用，催化效率Kcat/Km值（18.12±2.90 ） 高于（14.61±2.60 ）。只有在Mn2+存在时才检测到GS 的活性，由于GS催化L-谷氨酸生 成L-谷氨酰胺，而GR催化L-谷氨酸转化生成D-谷氨酸，因此，在Mn2+存在下，体系 中L-谷氨酸积累减少，而D-谷氨酸积累增加，导致发酵液中γ-D-PGA所占的比例增加。 检测谷氨酰胺合成酶体内酶活。通过HPLC对B. licheniformis WBL-3菌体破碎粗酶 液中的GS进行检测。在未添加Mn2+ 的反应液中未检测到谷氨酰胺的生成，而Mn2+存 在的反应液中，则检测到0.71 mmol/L的谷氨酰胺生成。以上结果与体内酶活实验吻合， 近一步说明了B. licheniformis WBL-3菌体内积累的L-谷氨酸浓度降低，使得γ-D-PGA 比例增加。 实时荧光定量PCR分别检测了B. licheniformis 中合成γ-D-PGA相关基因（谷氨酸消 旋酶编码基因racE 、D-丙氨酸转氨酶编码基因dat和谷氨酰胺合成酶编码基因gltA ）体 内转录水平，结果显示，在Mn2+作用下racE转录水平是无Mn2+ 的2.16倍，dat 的转录水 平是无Mn2+ 的4.44倍，gltA 的转录水平是无Mn2+ 的1.84倍。由此可见，B. licheniformis WBL-3 中L-谷氨酸代谢基因和D-谷氨酸合成基因的转录水平在Mn2+存在条件下均高 于无Mn2+ ，进一步证实了Mn2+ 的存在，使得体系中D-谷氨酸积累增加，导致发酵液中 γ-D-PGA所占的比例增加。 关键词：地衣芽孢杆菌；Mn2+ ；γ-D-PGA ；谷氨酰胺合成酶； I Abstract Abstract Bacillus licheniformis is a productive bacterium to efficiently synthesize poly-γ-glutamic acid by fermentation. The concentrations of Mn2+ can affect the configuration