猪pml的抗病毒作用及伪狂犬病毒对其产生的拮抗机制研究.docxVIP

猪 PML的抗病毒作用及伪狂犬病毒对其产生的拮抗机制研究 PML核体 (PML-NBs)是哺乳动物细胞中普遍存在一种动态的亚细胞核结构。 PML是 PML核体的主要组织者 , 参与多种生物学过程。 PML核体具有天然的抗病毒作用 , 与病毒感染和致病性有着密切的关系。目 PML抗病毒的机制还不十分清楚 , 对 PML生物学功能的研究也主要集中在人和小鼠 , 对其他动物 PML功能研究很少 , 开展猪 PML抗病毒作用的研究有助于深入理解 PML抗病毒的机制。 为开展猪 PML抗病毒作用研究 , 对猪 PML基因进行了克隆和特异性抗体制备；对猪 PML核体的亚细胞定位、 形态结构及生物学功能进行分析； 并以猪伪狂犬病毒 (PRV)感染为模型 , 探讨了猪 PML核体和病毒之间的相互作朋。 PRV感染可以干扰猪 PML-NBs的形成 , 为了进一步研究病毒哪些基因参与到这一过程 , 建立了一种基于 CRISPR/Cas9系统构建基因缺失 PRV的方法 , 将 PRV基因组和 CRISPR/Cas9 系统共转染 PK15细胞 , 拯救出来的病毒几乎 100%是被 CRISPR/Cas9编辑过的基 因缺失病毒；还建立了一种不依赖同源重组机制向 PRV基因组插入外源基因的方 , 该方法仅需要构建一个包含打靶序列和外源基因表达盒的供体质粒 , 将供体质粒、病毒基因组和 CRISPR/Cas9系统共转 PK15细胞 , 拯救出来外源基因插入的重组病毒效率高达 50%。 稳定表达猪 PMLⅡ可以抑制野生型 PRV增殖 , 而且对 EP0缺失毒株的抑制能力更强 , 显示猪 PML具有抗病毒作用。利用 TALEN技术构建猪 PML敲除的 PK15 细胞系 (SPML-/-PK15), 在 SPML+/+PK15细胞系上 , 猪 IFNa 对野生型及 EP0缺失病 毒均有较强抑制作用 , 且对 EP0缺失病毒抑制作用强于野生型病毒 ; 但在 SPML-/-PK15细胞系上 , 猪 IFNa 对野生型及 EP0缺失 PRV抑制作用减弱 , 同时猪 IFNa 对两种病毒抑制能力的差异减小 , 说明猪内源性 PML对猪 IFNa 介导抗病毒 作用至关重要 , 提示猪 PML参与到猪 IFNα诱导的固有免疫中。 PRV感染早期 , 猪 PML-NBs的形态结构就遭到破坏 , 病毒早期蛋白 EP0可以干扰猪内源性和稳定表达猪 PMLⅡ形成的 PML-NBs,而 EP0缺失毒株干扰猪 PML-NBs的能力显著下降。野生型 PRV感染引起稳定表达的猪 PMLⅡ降解 , 降解过 程依赖蛋白酶体途径 ,EP0 缺失病毒对猪 PML降解能力显著降低 , 表明在感染早期 对猪 PML-NBs的破坏主要是由 EP0介导的。 综上所述 , 本文克隆、鉴定猪 PML;证明了猪 PML本身具有抗病毒作用以及参 与 IFNa 介导的抗病毒防御；并初步探讨 PRV干扰猪 PML-NBs形成及逃逸猪 PML 抗病毒的机制；建立了一种基于 CRISPR/Cas9系统构建基因缺失 PRV的方法 , 为 深入了解猪 PML抗病毒及 PRV逃逸宿主防御的机制奠定了基础。