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细胞培养集锦 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题.见到很多很好的经验总结.这.里说一与我个人的经验?因为一些比较特 殊的原因，我白己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有乔余种，可以说遇到过许多各式各样古 怪的细胞。这巴挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最朿要，呦是近期看到大家频繁讨论 这个话题.我就抛砖引玉?下面几点拙见?可能与其它朋友总结的一些经验有点出入?仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤 其是细胞系的培养,就消化而言，不是太难,做得多了,善于总结经验.就能把细胞越养越好。?-?般的程序步 骤，细节操作.我这里就不讲了.只讲一些基木操作背后的知识.如果不对之处?欢迎指正.一起讨论： 其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后,残留的那些无法计算体积的附 着在细胞表血的微杲胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分Imin不到）。对于这些细胞原则上 不要用胰酶孵育细胞,连续这样传代,对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去,胰酶润洗吸去?然后 37度消化。 什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个I员I形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁 细胞层?只要能移动了?多半呈沙壮移动，其实己经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞? 这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着己经消失了，细胞之间的附着也己经消失了, 细胞己经独立分布JT （如然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞 都分离得非常好，间隙很大，才停止°细胞就是完金成单个细胞悬液，之后在贴唯的过程屮仍然会聚集，这个 是贴球培养的细胞，尤英是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你对以尝试，准备100%的单个 细胞悬液，贴壁后观察细胞.仍然是几个几个细胞聚集在一?起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要 去尝试过几个小时就拿出來吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养 就是一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下來，这个时候即使是成片的（比如Cdlm3细胞），吹打不超 过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或 者象有的同学那样吹打1h?等待单细胞悬液出现。 另一个帖子里捉到一个比较复杂的四步消化法，这个挺有意思，我也是第一次听说，应该是网友自己发 展出來的方法?很有参考价值。但我估计这个方法町能对付少数菲常怪异的细胞才需要这么复杂的程序。我冃 前养过的近300株细胞里面，还没遇到这么怪异的。比如Cnco2其实是很好消化的细胞.不需要胰酹孵育即叭 只是有点成片分布。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定。如果和标准形态不一致，那可能是自 己没消化好导致的?但如果消化方法正确?彳丿燃成片分仏 英至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布? 这是细胞的特性，是因为贴碟过程屮重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你 越來越不好。 比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以colon cancer为例，比如HCT15, LS411和KM12, 这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多,一般100 mm dish, 一次最多加入500uh就足够了, 一般我加300ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min,即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正 常细胞也会有难消化的时候?比如tsDC细胞，但也只要用少最胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。 常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），受消化影响不是很大，如果不用胰幅去孵育呦使 用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求极高。 这个时候.胰酹消化，就是润洗.都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多?细胞包装能力就会逐渐 下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酚消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。 这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。 EDTA的作用。许多人不用胰陋，只用EDTA.或者用trypsiiVEDTA联合作用。这里要明白.trypsin 切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合S离子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的 作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA,或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA.就是这 个道理。一般不要试图延长消化时间（如果lOmin还消化不彻底的话），而应该想