细胞培养升级篇.docVIP

细胞培养升级篇 细胞培养中的注意事项 1冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽屮快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水 面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管rh液氮桶屮取出解冻时，必须注意安全，预防冷 冻管Z爆裂。 2细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO? 除少数特别注明对DMSO敏感Z细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻Z后，应直接 放入含有10-15ml新鲜培养基Z培养角瓶屮，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免 大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。1 3可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。毎一细胞株均有其特定使用且己适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供Z培养条件不同之 培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极 大的影响。来白不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错谋常会造成 细胞无法存活。 5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误 的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum)则是指小牛血清。HS (horseserum)则是指马血清。 6培养细胞时应使用5 %或10% CO2?或根木没有影响？ 一般培养基屮大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基屮NaHCO3的含量将决定 细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10% CO厶 当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。 7何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基木数据上Z更换时间，按时更换培养基即可。 8培养基屮是否须添加抗生素？ 除丁特殊筛选系统屮外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9附着性细胞继代时所使用Z trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用Z trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于 无菌试管屮，保存于- 20 C,避免反复冷冻解冻造成trypsin Z活性降低，并可减少污染之机会。 10悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀鏗细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶 口端稍微抬高，直到无法容纳为II,分瓶时取出一部份含细胞Z培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培 养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。 11欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲冋收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约l,0()0rpm)，5?10分钟，过高Z转速，将造成细胞死亡。 12细胞Z接种密度为何？ 依照细胞株基木数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细 胞无法生长Z—重要原因。 13细胞冷冻培养基Z成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5?10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90?95 %原来 细胞生长用之新鲜培养基均匀混合Z。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO H接 加入细胞液屮，必须使用前先行配制完成。 14 DMSO Z等级和无菌过滤Z方式为何？ 冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade Z DMSO (如Sigma D2650),其木身即为无 菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4C,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解 而释出有害物质，并可减少污染Z机会。若要过滤DMSO,则须使用lW DMSO Z Nylon材质滤膜。 15冷冻保存细胞Z方法？ 冷冻保存方法一：冷冻管置于4 C 30-60分钟一(-20 C 30分钟)- -80 C 16-18小时(或隔夜)一液 氮槽vapor phase长期储存。 冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序Z可程序降温机屮每分钟降1-3 C至- 80 C以下，再放入 液氮槽vapor phase长期储存。*-20 C不可超过1小H、］,以防止冰晶过大，造成细胞大帚死亡，亦可跳过 此步骤直接放入?80C冰箱■■■■■■■ 16细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial为宜。 17应如