细胞培养污染的检验与去除.docVIP

第七节细胞培养污染的检验9去除 一、 细菌与霉菌的污染 曲于环境条件差和操作不当等原因，常可发生细菌和壽菌的污染。常见污染的细菌 有革兰阴性菌如：人肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有荷萄球菌等，真 菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、砲子 苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有意物质杀死细胞。 镜下可见脑浆内出现人量颗粒，细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。希菌污染容易发现，人 多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状 菌丝，纵横交错于细胞之间。细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见 小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。 抗生案及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。工作中要特别注意和防 I匕所用培养液和血清的污染，H前应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防止在培养细胞 时造成污染。 二、 支原体污染的检测与去除 （一）支原体的检测 pcre* 原理该法是通过PCR技术将支原体16srRNA棊因特异性扩增，來检测培养细胞中污染的支原体。 PCR引物选白16sr RNAS因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经混乙噪（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。 16sr DNA引物用水稀释至40umol/U （1） .正向引物：5, -ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3* （2） .反向引物：5, -TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3, 质粒pBR322引物用水稀释至40umol/L. （1） .正向引物：5, -CATCTCGGGCAGCGTTGGGT-3* （2） .反向引物：5 -AGCGCAAGCGGAGTGAGTGAGC-3? 裂解缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH8.3）, 50mmol/L KCL, 2.5mmol/L Mgcl2, 5g/L Tween20 和 5g/L TritonX-100o 蛋白酶K （proteinase K）贮存液：蛋白酶K20 mg/ml 溶于50%甘油中，于?200C贮存。 耐热DNA聚合酶（如feq聚合酶）与相应的10X TAE缓冲液（见附录A1） 琼脂糖（分子生物学级）；渙乙噪（10mg/ml溶于水中并避光保存）。 6X加样染液（40%甘油、0.125%漠酚蓝和125mmol/L EDTA）. DNA分子量标志（50ng/ml）、pBR322 DNA。 DNA扩增仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪（UV）、加样枪、PCR管（0.5ml或 0.2ml）。 方法与步骤 1） 样品制备 （1） 将106细胞悬液或贴壁细胞刮下来的悬液放1.5ml微离心管内，以最人转速离心15mino （2） 奔去上清，将细胞再悬浮T 100ul裂解液中，然后加蛋白酶K,使终浓度为60ug/mL （3） 置微波炉内600。脖育1h,然后升至950C10min,再将样品置室温中降温。 2） PCR扩增 （1）在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入： 10XPCR缓冲液 5.0ml 25mmol/LdNTPs 混合物 0.4ul 40umol/L 16sr DNA引物 每种引物 1.0ul 40umol/L pBR322 DNA 引物每种 2.0ul pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul DNA聚合酚（5U/ml） 0.2ul 三蒸水35.4ul 总量45ul （2） 用无菌去离子水稀释样品为1:10, 1:100o （3） 于每个eppendorf管中加45ul PCR扩增混合物,每管中分别加入样品原液及1:10, 1:100 稀科液备5ul,操作均在冰浴中进行。 （4） 在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油，覆盖在液面上。如DNA扩增仪带有有制 式热盖，此步骤可省略。 （5） 将各管放入DNA扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令： 950C10min 一个循环 950C, 30S-580C 1 min-720C 1 min,共 30 个循环。 最后720C10min延长循环。 3） PCR产物分析 （1） 制备含有EB染料（0.1ug/ml）的1 %琼脂糖凝胶（用TAE缓冲液制备） （2） 从PCR扩增仪中収出样品管，収10UIPCR扩增产物加到2』带有染液的加样液中，混匀后 加样到琼脂糖凝胶加样孔中，同时在对照孔中加10ul标准DNA分子量标志。 （3） 凝胶置TAE缓冲液中，电压80V,电泳60-90mino （4） 凝胶电泳完毕,将凝胶置紫外透射仪下观察，有无被EB染料着色的红色荧光DNA条带, 样品孔与标准