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细胞培养实验写报告内容 1目的 2原理 3材料与方法（操作步骤） 4实验结果 5结论或结果分析 实验一鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 实验一 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 实验二 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养） 实验三Hep-2细胞的传代培养 实验四VSV TCIDso 实验四 VSV TCIDso滴定 实验五干扰素活性（效价）的测定 实验六VSV中和试验（稀释血清固定病毒法）实验二 实验六 VSV中和试验（稀释血清固定病毒法） 实验二 鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养 一、 目的 1、 掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤； 2、 掌握活细胞的显微镜下观察； 3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、 原理 离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的 外界环境屮，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能牛 存、牛长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性， 比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织 细胞开始培养到第一次进行传代Z前的这一段时期称为原（初）代培养。原代细胞 最接近体内细胞的特性，因血对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的 增殖，药物的作用机制等的研究。 三、 材料（按2人/组的量发放） 名 称 数量 备 注 9?11 口龄鸡胚 1只 无菌器械 1套 无菌无毒平皿 2只 5或10ml吸管 4支 1或5ml吸管 1支 青霉素瓶（带塞） 2只 Hank s液 250ml 1640 RMPI 或 DMEM 500ml 双抗 5ml 胰蛋白酶 1ml 小牛血清 5ml 5.6% NaHCOs 3ml 碘酒和酒精棉球 若干 细胞培养瓶 2只 1、 在DMEM和Hanks液屮分别无菌操作以1%的量加入双抗，吸出10? 15mlHank?s液至无菌平皿屮备用； 2、 碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳； 3、 取出两只无菌平皿，并标记①和②，待用。 4、 大蹑子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳； 5、 消毒锡子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有Hanks液的 平皿①屮，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有HankM液 的平皿②屮，再充分洗涤； 6、 取出洗净的组织块置于大青霉素瓶小，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其 剪成约0.5?1mm的小块（约250次），此时体积约0.5ml；用Hank s5液 洗涤两次。 7、 按照10倍量加入0.25%胰蛋白酶，调节pH至约7.3?8.0 （肉眼观为肉 红色）盖上瓶塞，写好标记； 8、 将上述细胞瓶置于37°C水浴中,开始计时,约15?30min,其间缓慢摇 匀以充分消化。消化停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很 快聚集成团，表明细胞活力好。 9、 消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用Hank^液小心洗涤2? 3次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入DMEM液约5ml,用 小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。吸上清；重复操作3?4次，收集 细胞上清。 10、 （1）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集 上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为10%）,将细胞密度调到 约 IX 10个/ml。 （2）经四层无菌纱布过滤后收集滤液，并加入足量的小牛血清（终浓度 为10%）,将细胞密度调到约IX 10个/ml； 11、 将上述制备好的细胞悬液平均分配到2貝细胞瓶屮，5ml/瓶，塞好螺口 塞，注意牛长面朝下，在非牛长面上做好标记，包括细胞名称，接种培 养时间，组别及姓名等。 12、 细胞统一?置于本室指定的CO?孵箱屮培养。 13、 24h后观察细胞牛长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数 细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的牛?长而，说明细胞牛长状态良好。 实验三 滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养） 一、 实验目的 掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。 二、 实验原理 原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比 较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究。病毒在细胞内增殖的检测指标有 细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒 引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）,常见的细胞形态学变 化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。 三、 实验材料（按2人/组的量发放） 名 称 数量 备 注 2OOTCID5oVSV 0」ml 5ml和1ml吸管 各1支 维持液 100ml 含3 %小牛血清的 RPMI-1640 液或 DMEM 液 四、操作步骤 1、上述原代成纤维细胞培养24h后，一旦细胞完全贴壁牛长良好后，则轻弃培养上清，换丄细胞维