组织培养过程示例.docVIP

组织培养过程示例组织培养步骤 1、培养基配制 母液 品名 MS配方 (mg/ L) 10 大 量 元 素 母液1 硝酸钱 1650 母液2 | 硝酸钾 1900 母液3 硫酸镁 370 母液4 「 二水氯化钙 400 母液5 磷酸二氢钾 170 铁 盐 母液6 EDTA ??钠 37.3 「 硫酸亚铁 27.8 微 量 元 素 母液7 碘化钾 0.83 硼酸 6.2 一水硫酸镒 16.9 硫酸锌 8.6 钥酸钠 0.25 硫酸铜 0.025 2.5(称 50mg [ 氯化钻 0.025 2.5(称 50mg \ 有 机 物 母液8 肌醉 100 烟酸 0.5 VB6 0.5 VB1 0.1 甘氨酸 2 按照上表配成100倍母液8种，各配成1L,各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签， 注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中 MS培养基中还需要加入蔡乙酸（NAA）、6?节氨基喋吟（6-BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母 液（1 mg/mL）。其配制方法是：分别称取这2种物质各10Omg, NAA用少最乙醉溶解，6-BA用少 量的NaOH溶液，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL,即得1 mg/mL的母液。 1当量轼氧化钠：称取4gM氧化钠，加蒸徭水定容到100mLo 1当最盐酸：最取浓盐酸9mL,加蒸镭水定容到100mLo 以配制1 L培养基为例： 用戢筒或移液管从各种母液屮分别取出10ml,与各种母液一起放入烧杯屮。然后戢取所需浓度的NAA或 6-BA加入烧杯屮，称取廉糖30g,加入烧杯后，定溶到1 L。 调pH值 用酸度计或PH试纸测溶液PH值（可用1当量的氢氧化钠和1当量的盐酸调节PH值直到培养 基的pH为5.8为止），培养基的pH必须严格控制在5.8。 称取5g左右琼脂粉倒入烧杯屮,然后在电炉上加热，边加热边用玻璃棒搅拌，宜到液体呈半透明状。 培养基的分装溶化的培养基应该趁热分装。将烧杯中的培养基倒入培养瓶中,注意不要让培养基沾到瓶 口和瓶壁上。每1L培养基,可分装25?30瓶。 培养基分装完毕后，用硫酸纸或封口膜及时封盖瓶II。如果组培瓶有盖则盖上盖子。 培养基参考： 增殖培养基：MS+ BA2.0mg/L+ NAAO. 1 mg/L+ 糖 30g/L+ 琼脂粉 5g/L 生根培养基：MS+ NAA0.2+蔗糖30g/L+琼脂粉5g/L 培养基配方是在不断实践摸索中，才能找到最适合的培养基。 2、 培养基灭菌 将分装好的培养基放入高压蒸气灭菌锅灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的裁汽不能外 溢，压力不断上升，使水的沸点不断捉高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达 121°CP在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽總。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但冃 的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到 0.05MPa时，打开放气阀，放出空气待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，刃:始计时，维持压力0.1-0.15MPa, 20分钟。 到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa,可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以 致引起激烈的减压沸腾，使容器屮的液体四溢。当压力隆到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上， 以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久,山于锅炉内有 负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了 灭好菌后，让培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用 3、 接种 植物材料表面用消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物o这些污染源一旦带入培养基,便会造成 培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作于续接种到培养基上,这一过程 叫做接种。接种的植物材料叫做外植体（explant）。 首先，将采來的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干挣，如用适当的刷子等刷洗。把材料 切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自來水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料淸 洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严:ffi时特别有用。 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除 去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表血活性物质吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超挣台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒 精、