应用微生物：第二章 第一节 油气资源的微生物勘探和开发 .pptVIP

* * * * * * * * 特点三：实现靶向激活与定向调控 针对油藏中有利于采油的内源微生物,激活它。也就是说油藏中有很多很多的微生物，通过检测，了解从而锁定激活目标，根据目标微生物的特点――包括需要什么要的营养、与其它微生物存在什么样的关系等等注入特定的激活剂，从而使目标微生物数量剧增，并开始发挥作用。 通过靶向激活就是为了要激活油藏内源优秀采油微生物。 * * 系统生物学——分子微生物生态 海洋沉积物 108-1010 /kg 0.01-0.1% 活性污泥 109-1011 /kg 10% 土壤 可培养性 Habitat 种群大小 1010-1012 /kg 0.1-1% 占油藏微生物99％以上的、目前难以被培养的微生物是油藏微生物的功能主体，是微生物采油技术应该开发的主要对象！ 微生物不可培养的原因 人类对微生物生长条件、生长规律以及相关因素了解不远远不够 由于环境很恶劣，很多功能微生物实际处于休眠状态，如同动物的冬眠 根据对微生物的估计人为“主观”地、“武断”地设计微生物的培养基、培养条件，绝大部分微生物在人类实验室中“水土不服” 爱斯基摩人可以在北极冰天雪地中生活，在赤道酷热的环境就不能适宜 系统生物学——分子微生物生态 传统微生物培养方法的缺陷 采用富营养培养条件 (LB 培养基） 1克土壤含有约1500－5000种微生物，约109个细胞，对微生物来说土壤实际上是一个十分“贫困的乡土” Bloomfield理论： 将实际“寡营养”的微生物迅速置于富营养状态，微生物初期的快速生长会同时产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物和羟基自由基等“毒性氧物质”(Reactive oxygen species)，该类物质快速、过量的积累会破坏细胞内膜结构，导致细胞死亡，从而表现为微生物的不可培养性。 传统微生物培养方法的缺陷 忽视微生物间的联系 微生物间的信息交流，信号分子：酰化高丝氨酸内酯，改良的寡肽 微生物的种间作用——共生 没有充分了解环境中的化学组成和环境条件（培养条件和培养基成分过于简单） 不能提供微生物生长所必须的基质 利用恒温代替自然温度 细菌聚集生长 生长最快的菌种占优势，其他菌不能生长。 T-RFLP pattern B. DNA 指纹印记法 限制性终端片断长度分析法 (T-RFLP analysis) 变性梯度凝胶电泳分析法 (DGGE analysis) A. RNA 杂交和印迹法 荧光原位杂交 (FISH) 1997, Wen-Tso Liu, Larry Forney 1993, Gerard Muyzer D. 基因芯片法 功能基因 Geochip 4.0 石油微生物种群 Petrochip 1.0 C. 宏基因组法 高通量测序 (Hi-seq) 2006, Ji-zhong Zhou 2013-2015，863正在研制 克隆文库法（Cloning Library） 16S rRNA基因文库是将环境样品中的所有DNA进行16S rDNA扩增，再将其随机连接到克隆载体上，得到包含所有代表微生物种属信息的基因文库，文库中拷贝数多的克隆代表该基因（种属）在环境中的数量多，以OUT表示。该方法是信息量最大的分子生态学方法，缺点是时间长，需要耗费大量的时间和金钱 。。。 环境样品总DNA PCR扩增 随机连接到载体上 得到基因文库 测序 扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析 (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA) 将16S rDNA-PCR技术与RFLP技术相结合而发展起来的微生物多样性研究技术；即采用识别4个碱基的限制性内切酶对克隆获得的16S rDNA进行酶切，通过电泳分析酶切后的片段长度多态性。 终端限制性片断长度多态性分析(T-RFLP) T-RFLP--末端限制性片段长度多样性，又称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，日亦受到研究人员的重视。该技术已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征等多方面。 T-RFLP还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大。 如不需要定量，则可采用相对便宜的限制性片段长度多态性（RFLP）分析，即末端不需要加入荧光标记，只需进行分类和测序。 B A C Environmental sample (1) DNA extraction Mixture of microbial DNA (3) Restriction enzyme digestion 5’