盐地碱蓬愈伤组织原生质体的分离纯化.docxVIP

盐地碱蓬愈伤组织原生质体的分离纯化 Isolation and Purification of Suaeda salsa Protoplast from Callus Han GuoLiang ， Yang JianChao ， Sui Na* (College of Life Science ， Shandong Normal University/Shandong Key Laboratory of Plant Stress Research ， Jinan 250014 ， China ) The optimal enzyme prescription and mannitol concentrations for protoplast extraction from Suaeda salsa callus were tested in this paper ， and also the optimum purification method. The results showed that the optimum conditions for protoplast separation were 0.7 mol/L mannitol ， 3.0% cellulose ， 1.0% macerozyme and 0.2% pectolase. 盐地碱蓬( Suaeda salsa L. )是典型的稀盐盐生植物，主 要分布在欧洲和亚洲，我国东北、西北、华北及沿海各省的盐碱 地均有分布，在海滩以及盐湖边形成单优群落 [1] 。盐地碱蓬是 真盐生植物中一种良好的研究材料， 目前其耐盐的生理机制研究 已经取得较大的进展，克隆了 HKT1 NHX1和SAM等耐盐基因， 初步揭示了稀盐盐生植物在液泡水平离子区域化提高耐盐性的 机制[2， 3] 。由于不清楚盐地碱蓬的遗传背景，虽然再生体系已 经有所突破， 但仍然无法对其进行常规的遗传转化， 无法将这些 基因在盐地碱蓬中进行过量表达或者沉默来更深入研究耐盐的 分子及机理 [4] 。将原生质体作为遗传转化体代替常规的外植体， 通过PEG介导、农杆菌培养共转化以及电击穿孔等转化方法获得 转化植株 [5] ，可以为遗传转化体系建成提供新的思路，目前已 经在马铃薯等高等植物的原生质体中获得转化植株 [6] 。 成熟的盐地碱蓬细胞，中央液泡发达，原生质体容易破碎， 在原生质体培养和细胞全能性上不如愈伤组织 [7] 。植物原生质 体的纯化一般联合运用过滤法、 离心法和漂浮法， 经过较长时间 的发展，原生质体的分离方法越来越完善。目前以纤维素酶、半 纤维素酶和果胶酶配合的酶解分离法成为最成熟的方案， 已经在 洋葱、扁蓿豆、沙葱等植物的愈伤组织中成功提取原生质体 [8? 10] 。本研究利用盐地碱蓬愈伤组织获得原生质体，探索其原生 质体提取过程中所需要的各种酶浓度及其比例及最适甘露醇浓 度，得到最佳盐地碱蓬原生质体的纯化方法， 为利用原生质体建 立遗传转化体系奠定基础。 1 材料与方法 试验材料 盐地碱蓬种子于 2011年 11月采自中国东营黄河三角洲自然 生境盐碱地，晾干后去掉果皮储存于 4C冰箱备用。 1.2 试验方法及处理 1.2.1愈伤组织的诱导 盐地碱蓬种子先用70% (V/V)的乙 醇消毒5 min,接着用3.6% NaC 10消毒15 min，无菌水冲洗5? 6遍，接种于无激素的 MS培养基上（pH 5.8?6.0 ），在温度为 （25± 2） C、相对湿度75%条件下培养10天，获得无菌苗［11］。 取生长10天的无菌苗的下胚轴（直径约为0.1 cm）剪成长0.5? 1.0 cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基（MS+0.5mg/L 2, 4-D+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA暗培养28天后得到白色的愈伤组织［12］, 作为酶解的原材料。 原生质体的分离 收集盐地碱蓬愈伤组织，分别放入 用磷酸缓冲液（取 0.2 mol/L NaH2PO4 ? 2H2O 87.7 ml 和 0.2 mol/L Na2HPO4- 12H2O 12.3 ml 混合，调节 pH为 6.0 ）配制的 甘露醇浓度分别为 0.5、0.7 和 0.9 mol/L 的三种洗涤缓冲液中 进行质壁分离1 h ;用刀片将质壁分离后的愈伤组织切割；将处 理好的愈伤组织和10 ml原生质体酶解液（CaCl2 ? 2H2O MgCl2 - 6H2O Na2HPO4 12H2O NaH2PO4 2H2O 纤维素酶 R-10、 离析酶 R-10 果胶酶 Y-23 BSA DTT 乙二胺四乙酸 甘露醇 蔗糖）放入三角瓶中，于黑暗条件下在台式摇床中培养 7h；分 别用 100 目和 400目尼龙网过滤酶解液到培养皿中，用 5