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2021/3/26 * 2.6 对照品 阴性对照品须先行检测,确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg。 阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质,其中加入一定量的待检物质,此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5 ng/ml，阳性对照品中含量约为10 ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。 2.7 标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。 2021/3/26 * 1、样品的采集与保存 2、试剂的准备 3、包被 4、加样　　在ELISA实验中一般有5次加样步聚,即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。 三、ELISA实验过程 2021/3/26 * 4、保温　在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。 2021/3/26 * 5、洗涤　　目的:分离游离的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 　　洗涤的方式:自动洗涤仪与手工操作。 a.吸干或甩干孔内反应液; b.用洗涤液过洗一遍; c.浸泡,即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟， 间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短; d.吸干孔内液体; e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。 2021/3/26 * 6、显色和比色 显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。 底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深,约40分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。 2021/3/26 * 酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。进行ELISA分析时,酶和酶的底物结合时便产生呈色反应,凡应后用酶标仪测定反应液的吸光度，是“专业化”的光度计。 DNM-9602 标配酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪 2021/3/26 * 结果判定 定性测定: 1）间接法和夹心法。在间接法和夹心法的ELISA反应体系中,反应的定性结果可以用肉眼直接判断。 若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性 若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性 若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性 2）竞争法。与间接法和夹心法ELISA检测相反,在竞争法ELISA中阴性孔呈色要深于阳性孔。 2021/3/26 * 定量测定 在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。 2021/3/26 * 第七章 酶联免疫吸附分析 2021/3/26 * 抗原:抗原是指进入人或动物机体后,可刺激机体免疫系统发生免疫应答,从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞,并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体:是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性:a、反应的特异性;b、反应的等比例性 2021/3/26 * 抗原-抗体识别反应示意图 2021/3/26 * 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂