生物化学实验十 动物基因组DNA提取最终稿.pptx

动物基因组DNA的提取;一、实验目的 二、实验原理及方法 三、实验器材 四、实验步骤 ;?学习和掌握从动物组织中提取基因组DNA的原理和操作技术 ;1 核酸的理化性质 2 核酸制备的步骤 3 核酸制备中常见问题及注意事项;（1）在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 （2）微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 （3）在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较 稳定。 （4） DNA溶液粘度很大 （5）在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来 ;2.2 核酸制备的一般步骤：; 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法 （非机械法中溶胞法是应最广泛的方法） ;;DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 ;核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 ;(2) 核酸的分离与纯化：;核酸制备中常用的蛋白质变性剂 作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC ;沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤;核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 -20℃保存,避免反复冻融 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)：TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 ;基因组DNA收率较低或无基因组DNA 样本材料太少 细胞破裂不够充分，DNA释放不完全 离心力偏小 两相分离不完全… … ;DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因组DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护DNA长度 ;核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解：排除核酸酶 ;实验材料：鱼 实验试剂：上海生工动物基因组DNA快速抽提 试剂盒 实验器材： 仪器：高速离心机、水浴锅 试剂：75%乙醇、异丙醇、Rnase A 溶液等 耗材：1.5ml离心管、研钵 ;四、标准抽提步骤;Buffer digestion：主要成分是Tris-EDTA,SDS。 SDS是表面活性剂有助于DNA的释放， Tris的作用是调节PH， EDTA是螯合剂，是结合核酸酶放置DNA的降解。 Buffer PA：主要成分是醋酸盐溶液， 主要作用是沉淀蛋白质，纯化DNA。 ; 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定