生化实验兔血清醋酸纤维素薄膜电泳.docx

血清醋酸纤维素薄膜电泳 一、 目的要求 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理及操作过程。 熟悉兔血清中各种蛋口质相对含量的测定原理和方法。 二、 实验原理 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的主物分子，如氨 基酸、多肽、蛋口质、核昔酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的 pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电 荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样 品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生 不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。电泳过程必须在一 种支持介质中进行。自山界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强, 影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳 过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素 膜。山于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度, 所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的 稳定。 醋酸纤维素薄膜 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素酷酸酯，将它溶于有机溶剂 （如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，待溶剂蒸发 后则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 nm, 有很强的通透性，对分子移动阻力很小。本实验采用醋酸纤维素薄膜作为介质。 蛋白质 蛋白质是山氨基酸组成的，其分子中除两端的游离氨基和竣基外，侧链中尚有一 些解离基，作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带 的电荷。蛋口质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨 基酸的含量，乂受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质 游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，此时溶液的pH值称为蛋白质 的等电点。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋口质溶液的pH大 于等电点，该蛋口质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。各种蛋白质分子曲于所 含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数H不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基 酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质， 等电点就偏酸性。蛋口质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白 质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋口质为 负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基 团不同，在同一 pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。 血清中含有白蛋白、a -球蛋白、球蛋口、Y-球蛋白等，各种蛋白质由 于氨基酸组成、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速 度不同。曲表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0,所以在 pH二8. 6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 蛋口质名称 等电点（PI） 相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 a 1 -球蛋白 5.06 200000 a 2-球蛋白 5.06 300000 球蛋白 5.12 90000-150000 丫-球蛋白 6.85-7.50 156000-300000 因此，本实验采用pH=8.6的巴比妥-巴比妥钠溶液作为电泳的缓冲溶液。 三、实验仪器与试剂 实验仪器 电泳仪、点样器、分光光度计、剪刀、滤纸、镶子、培养皿、试管架、试管、洗 耳球、吸量管、玻璃板 实验试剂 巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.06）：称取巴比妥1.66克和巴比妥钠12.76克, 溶于少量蒸憎水中，定容至1000毫升。（每两组配制一份） 染色液：称取氨基黑10B 0.5克，加入蒸镭水40亳升、甲醇50毫升和冰酷酸10 毫升，混匀，保存备用。（无需自己配制，实验室提供） 漂洗液：量取95%乙醇45毫升，冰酯酸5毫升和蒸镭水50毫升，混匀，保存备 用。（每组配制一份） 四、实验步骤 浸泡醋酸纤维素薄膜 选择质匀、孔细的醋酸纤维薄膜，在无光泽面的一端1.5 cm处，用铅笔轻画一 横线作为加样线并编号，然后无光泽面向下置于装有pH8.6的巴比妥缓冲液中， 并使之完全浸没，选取在15~30秒内迅速润湿且表面无斑点的酷酸纤维素薄膜， 浸泡约20-30分钟。 点样 用银子从缓冲液中取岀醋酸纤维薄膜置洁净的滤纸上吸去多余的水分，使醋酸纤 维薄膜既保持湿润状态乂无明显的水分，注意不能吸得太干，以免影响导电，导 致电泳图谱有条痕，亦不能留存过多的缓冲液，以避免点样时血清随着缓冲液而 扩散开来，导致电泳图谱分离不齐。 将醋酸纤维薄膜置于洁净的滤纸上，无光泽面向上。用毛细吸管吸取约5HL猪 血清，均匀涂抹于载玻片较窄一端的端面上，然