发酵工业菌种选育及保藏.ppt

第二章 菌种选育、保藏与复壮;2.1 菌种选育;方法;一、菌种的来源 根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买。 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。;二、从自然界分离筛选新种的步骤 定方案： 采样： 增殖： 分离：纯种分离和筛选 性能鉴定：菌种鉴定、发酵性能测定、毒性试验。 ;土样采集方法;植物体采集方法; 水样采集方法;1.稀释平皿分离法;1.稀释平皿分离法;2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法;1.概念：是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选、排除劣质形状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株。 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9。 ;2.导致菌种退化变异的原因：;3.自然选育操作步骤： ;（二）、诱变育种;（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题;（3）诱变剂的选择;吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 紫外线仍十分有效。 电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。 ;3、诱变育种的一般步骤 出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选 ;(1)出发菌株的选择;要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。 ; (2)处理菌悬液的制备;(3)诱变处理; (4)中间培养; 方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。 若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。 ;(5）分离和筛选;初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。;一、紫外线的诱变育种; 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。; 操作步骤 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2．将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。 ;3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。 ; 4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。 ;二、亚硝基胍诱变曲霉菌; 操作步骤 1．单孢子悬液制备 取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液 。 2．MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。; 3．诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。 4．死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。 5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选． ;（三）营养缺陷型的选育;1.与筛选营养缺陷型有关的三类培养基 ①基本培养基（M．M．minimal me