高效液相色谱法培训课件PPT[文字可编辑].pptVIP

色谱柱的连接 Stop_depth 长度不合适造成柱前死体积 色谱柱的连接 锥箍锥度不合适造成渗漏 ? 色谱柱使用与保存 ? 所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积 20-30 倍的水冲洗色谱柱 ? 色谱柱 柱体积 冲洗体积 ? 150 × 4.6mm 2.5ml 50ml ? 200 × 4.6mm 3.3ml 65ml ? 250 × 4.6mm 4.2ml 80ml ? ? ? 保存色谱柱时用 100% 甲醇或乙腈，柱 两端必须用接头密封。 停用数天后最使用时，应先用低流速 甲醇冲洗 1h 左右，然后再换上流动相， 否则直接用流动相，柱效会下降，峰 形不好。 新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗 （ 0.5ml/min ）。 色谱柱失效的原因 色谱柱失效症状 ? 色谱柱压增高 ? 进口滤片堵塞 ? 峰变宽，拖尾，裂峰 ? 吸附了样品杂质 ? 塔板数下降，选择性 ? 柱填充不良，使用久， 下降，分离度降低 ? 机械及热冲击造成空洞 ? 保留值减小或增大 ? 固定相遭化学侵蚀 ? ? ? ? ? 原因 压力 拖尾 塔板数 选择性 保留值 堵塞 # ## ## 空洞 ## ## 吸附样品 # 化学冲击 # # ## ## 柱凹陷 —— 出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐 平，可用相同填料填平凹陷处。 ? 压力影响 —— 应避免突然的压力波动与任何的机械 与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱 温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动， 会使色谱峰产生裂隙。 ? ? ? 柱压升高原因 强保留样品组分——强吸附组分易聚集在柱进 口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物 样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现 时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。 ? 解决办法 ? 使用保护柱可延长分析柱寿命。 ? 每天实验后应用强溶剂（例甲醇 - 水等，至 少 20-30 倍柱体积的量）冲洗色谱柱。 ? 并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长 时间冲洗色谱柱。 ? ? ? 样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。 ? 可用滤膜过滤样品后再进样。 样品浓度高——连续进样，造成过载。 ? 如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在 1mg/ml 以下较适宜。 流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大— —在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还 磨损泵、进样阀密封圈造成漏液。 ? 缓冲液浓度一般控制在 20mmol 以下较适宜， 测定完毕后必须及时用水充分冲洗。 注意！ 一旦柱压升高，应停止测定，用水 冲洗数小时或更长时间，待压力下降后 再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应 逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。 ? ? ? ? 柱效低的原因 频繁更换流动相组成——加速柱效降低。 ? 最好一根色谱柱使用的流动相成分和 pH 值 相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下 工作。 色谱柱的选择不合适或使用时间久 ? 更换色谱柱（厂家，型号） 进样操作不当 ? 转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或 停顿，否则易造成裂峰。 ? ? 样品溶剂与流动相成分不匹配 样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿 峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流 动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰， 改变样品溶剂成分或比例，使醇 - 水比例 接近于流动相。 前沿峰 倒 峰 注意 避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物，含强络合剂的溶液等。 流动相 使用前 过滤—— 用滤 膜过滤或垂熔漏 斗过滤 脱气—— 采 用超声或过滤 的方法 使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 冲洗 必须用不含盐的有机溶剂 - 水冲洗！ ? 进样阀 定量圈 1 泵 2 6 废液 泵 定量圈 1 2 6 废液 5 3 柱 Load 4 进样孔 废液 3 柱 Inj