临床生物化学检验：第5章 临床生物化学常用分析技术.pptx

第五章 临床生物化学常用分析技术教学目标与要求掌握：紫外-可见光谱分析的方法、原理及其在临床生物化学检验中的应用和评价。熟悉：原子吸收光谱分析、荧光光谱法的原理及应用、免疫化学分析技术中免疫浊度分析、酶免疫分析和发光免疫分析的原理、分类和临床应用。了解：离子交换层析、高效液相层析、亲和层析和质谱分析技术的原理和临床应用。主要内容第一节 光谱分析技术第二节 层析技术第三节 免疫化学分析技术第四节 质谱分析技术临床生物化学检验常用分析技术光谱分析技术离心技术电泳技术电化学分析技术层析分析技术免疫化学分析技术质谱分析技术核磁共振分析技术第一节 光谱分析技术（spectral analysis technology）概念：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的 特征，来确定其性质、结构或含量的技术。分类：依据光谱谱系特征，分为三大类 发射 吸收 光谱分析技术 散射一、吸收光谱分析法概念：在连续光谱中某些波长的光被物质吸收后产生的光谱称为 吸收光谱（absorption spectrum）。本质：物质的吸收光谱取决于物质的结构。基本定律：朗伯-比尔定律（lambert-Beer law）。分类：分子吸收光谱 原子吸收光谱主要方法：紫外-可见分光光度法 原子吸收分光光度法（一）紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法（ultraviolet visible spectrophotometry,UV-VIS） 根据物质分子对波长200∽760nm范围电磁波的吸收特性而对物质 进行定性、定量和结构分析的方法。 朗伯定律：光吸收与液层厚度的关系 比尔定律：光吸收与溶液浓度的关系 I0:入射光强度；I:透射光强度； c:溶液浓度；b:液层厚度； T：透射率，T=I/I0朗伯—比尔定律的数学表达式 　A=lg(1/T)=-lgT=kbc　A为吸光度（absorbance,A）。k为吸光常数（摩尔吸光系数），它与吸收物质的性质、入射光的波长λ、溶液温度、溶剂性质有关。　物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与溶液（吸光物质）浓度c及液层（吸收层）厚度b成正比。朗伯-比耳定律成立的前提：　(1) 入射光为平行单色光且垂直照射；　(2) 吸光物质为均匀非散射体系；　(3) 吸光质点之间无相互作用（分子间互不干扰）；　(4) 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收,无荧光和光化学现象发生。吸光常数k（absorptivity constant）两种表现形式：（1）摩尔吸光系数ε：在一定波长下，液层厚度为1cm,溶液浓度c为1mol/L时测得的溶液吸光度值。（2）百分比吸光系数E：在一定波长下，液层厚度为1cm,溶液浓度c为1g/dl时测得的溶液吸光度值。换算：E= ε*10/MW,MW为相对分子质量。应用：反映了物质对光的吸收能力，也反映了分光光度法测定物质的灵敏度。k越大，方法的灵敏度越高。多组分光度分析理论基础： 当溶液中有多种吸光物质时，总吸光度等于吸收介质内各吸光物质吸光度的总和；即吸光度具有加和性。 A总=A1+A2+…+An定量分析方法校准曲线法吸光系数法对比法自动生化分析仪常用的分析方法校准曲线法一系列浓度不同的校准品→显色→测吸光度→校准曲线（A vs c) 优点：方便、简单，特别适合样本量大的分析。 注意： ①测定条件发生变化，重新绘制； ②校准物应有较高纯度，准确配制校准液； ③待测溶液吸光度超过线性，稀释标本后再测定； ④标本测定的条件应和校准曲线的条件完全一致。校准曲线示意图吸光系数法根据 A=k*b*c,求c。 如NADH：260nm时的ε为15 000 L/mol/cm; 340nm时的ε为 6 220 L/mol/cm。优点：简单方便，常用于待测物含量的测定，无需配制校准物溶液缺点：不精确，如杂质或试剂成分在该波长有吸收，则结果偏高。应用前提：没有校准物。主要用途：脱氢酶活性测定 用脱氢酶作指示酶的代谢物测定注意：事先论证，谨慎应用。 对比法将校准物与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。前提：测定体系的温度、液层厚度、入射光波长均一致，校准物与待测样品的ε值和b值相等。计算：As=k*b*Cs,Au=k*b*Cu,Cu=Cs*Au/As Cs、Cu分别为校准品和待测样品的浓度 As、Au分别为校准品和待测样品的吸光度应用范围：许多生化项目、酶试剂的终点法特点：简便快速，但误差较大。要求校准物与待测样品浓度相近自动生化分析仪常用的分析方法主要为分光光度法。按检测类型分类：终点法 连续监测法定时法（固定时间法）可以看作终点法或连续监测法的特殊形式紫外—可见分光光度法的应用紫外—可见光谱是临床生化检验中应用最广泛的一种光谱。应用范围：