分子生物学实验设计.docx

分子生物学实验设计 彭杰 2012141241104 摘 要：绿色荧光蛋白(green fluorescent proteinAGFP)是源F海洋生物多管水母属(aequoia victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发卜一发岀绿色荧光，能在活细胞 内稳左表达，本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒纯化质粒，釆 用氯化钙法将工程菌DH5a制成感受态细胞，然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞屮, 使得工程菌DH5a转化成具有抗氨节青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋白，接种于加氨节青 霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆。 实验目的：获取发绿色荧光的大肠杆菌BL21 实验材料: 仪器 2、 恒温摇床3、 恒温水浴5 2、 恒温摇床 3、 恒温水浴 5、隔水式培养箱 7、台式高速离心机 9、高压灭菌锅 11＞制冰机 4、超净工作台 6、琼脂糖凝胶电泳仪系统 8、凝胶成像系统(Dark Reader) 10、10、100、1000 uL微量移液器各一支 12、恒温培养箱 14、漩涡混合器 材料 1、 少量含PEGFP-N3和pET - 28a质粒的菌液 GATCC 312、 限制酶 BamH I 51 - GAGATCC ? 3— 5* G GATCC 31 3- CCTAG 个 G -51 — 3* CCTAG 3、 限制酶 Not\ S-GCAGGCCGC- S，ASA-GC GGCCGC-31 3 ..? CGCCGG 个 CG-bK-CGCCGG CG ...51 4、 0.2mL EP 管架 5、 1.5ml塑料离心管 6、 一次性手套 7、 大肠杆菌DH2a和BL21 8、 氯化钙 氢氧化钠乙醇氯仿蔗糖硼酸 9、 乙二胺四乙酸(EDTA) 10、 三疑甲基氨基甲烷(Tris) 11、 氨节青霊素 22、浪酚蓝 13、 PCR产物快速胶回收试剂盒 14、 dNTP混合物 15、 引物对(正反向引物) 16^ Ex-Taq B DNA 连接酮 17、 酵母提取物胰蛋白腺氯化钠 18、 小指管.吸头、培养皿.三角瓶、试管等 试剂 ?1 LB培养液：胰蛋白丿冻(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g, NaCI5g,琼脂(固体培 养基)15g,用 IN NaOH 调 pH 7.5。 2、 溶液[:50mmol/L $UJ萄糖,lOmmol/ EDTA-Na, 25mmol/L Tris-HCI （pH8 - 0）作用：分散细 胞，螯合金属离子使酮失活，防止DNA的降解 3、 溶液 II: 0.4mol/L NaOH , 2%SDS 临用前 1:1 配制 作用：纽I胞在NaOH和SDS溶液屮裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性 4、 溶液III： 5mol/L醋酸钾60m冰醋酸11. 5ml双蒸水28. 5ml 作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上淸液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合 物等发生沉淀 5、 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25： 24： 1 ） 作用：氣仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是 DNA在上淸中。异戊醇防止抽提液起泡。 ?6、Gold view （DNA染料）0.5XTBE缓冲液 上样缓冲液（6x） ?7, ddZO, lOxbuffer 8、5XTBE （5倍体积的TEB贮存液）lOOOmL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA （Ph8.0） 20pL 9、RTE 将 RNA 酶溶于 lOnunol/L Tris-HCI （Ph7. 5）、15mmol/L NaCI 中,配成 lOmg/MI 的浓 度，于100°C加热15min,缓慢冷却至室温，10000r/min禽心5min,上淸液于一20?保存。 10x凝胶加样缓冲液（10x loading buffer） 浪酚蓝0.4%蔗糖60% 11、 2. 5mmol/L dNTP 混合物 IU/pLTaq 酶 10X PCR buffer （含镁离子） 12、 200mg/niL IPTG:取2glPTG溶于8mL双蒸去离子水中，再用水补至10mL,用0.22pm滤 膜过滤除菌，每份5L,贮存于一 20° 6 *IPTG作为具有lac或tac等启动了的表达载体的表认诱导物使用 实验步骤： （-）质粒DNA的提取：（两种质粒分别在两个EP管中操作） 1、 将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌分别接种在液体培养基屮（加氨节青 恁素50pg/mL） ,37°C培养过夜。 2、 取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管屮，10000rpmx2min,弃上淸液 3、 加入lOOpiL溶液I,漩涡器上充分混