一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR方法发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 113249525 A (43)申请公布日 2021.08.13 (21)申请号 202110713012.9 (22)申请日 2021.06.25 (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92号 (72)发明人 李建国　高泽峰　李珍　夏娟　 吴长新　 (74)专利代理机构 太原申立德知识产权代理事 务所(特殊普通合伙) 14115 代理人 郭海燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/70 (2006.01) C12Q 1/6858 (2018.01) 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图1页 (54)发明名称 一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT-PCR 方法 (57)摘要 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴 定新型冠状病毒印度变种的qRT‑PCR方法。本方 法为提升检测灵敏度和特异性，引入TaqMan探 针；为降低成本，将2对引物改为1对半引物，即：2 条上游引物分别靶向突变位点和原始未变异位 点，1条下游引物为2条上游引物共用。为增强变 异检测的灵敏度，在上游突变引物变异位点5’方 向第3个位点引入突变，通过降低反应体系中变 异引物与未变异病毒核酸和未变异引物与变异 病毒核酸的匹配度，造成反应体系中变异引物扩 增变异病毒核酸的扩增曲线早于扩增非变异核 A 酸的扩增曲线，同理，非变异引物扩增非变异核 5 酸的扩增曲线早于变异核酸的扩增曲线。 2 5 9 4 2 3 1 1 N C CN 113249525 A 权　利　要　求　书 1/2页 1.一种鉴定新型冠状病毒印度变种的qRT‑PCR方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，使用Trizol法提取新冠病毒RNA； 步骤2，基于ARMS的qRT‑PCR引物探针设计： 步骤2.1，引物设计：按照引物设计通用原则，结合新型冠状病毒印度变种的变异位点 附近核苷酸序列，对每个变异位点设计两对引物，其中上游引物3’端分别匹配变异和非变 异点，即变异上游引物和非变异位上游引物，两对上游引物共用一个下游引物； 当需要鉴别的变异位点为L452R时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示： 5’‑GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTATCG‑3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2所示：5’‑GATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCT‑3’，下游引物如SEQ  ID NO.3所示：5’‑ GGAAACCATATGATTGTAAAGGAAAGTAAC‑3’； 当需要鉴别的变异位点为T478K时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示： 5’‑TATCAGGCCGGTAGGAA‑3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示：5’‑ TATCAGGCCGGTAGCAC‑3’，下游引物如SEQ  ID NO.6所示：5’‑TTGCTGGTGCATGTAGAAGTTC‑3’； 当需要鉴别的变异位点为P681R时，变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示： 5’‑GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCACG‑3’，非变异上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所 示：5’‑GCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCC‑3’，下游引物如SEQ  ID  NO.9所示：5’‑