骨髓间充质干细胞培养.pptVIP

骨髓间充质干细胞培养 1.序言 2. 试验方法 3. 结果 4. 结论 关键内容 序言 　　最近研究表明, 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)不仅含有起源广泛、易于获取、增殖快速、可自体移植、体外基因转染率高等特点, 而且在不一样诱导剂培养下可分别诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞, 神经细胞及肝细胞等已成为适合组织和细胞移植种子细胞, 以及基因诊疗理想靶细胞。但在骨髓中骨髓间充质干细胞含量极低, 仅占骨髓有核细胞总数0.001%-0.1%, 怎样为组织和细胞移植及基因诊疗提供数量充足、活性良好骨髓间充质干细胞成为中国外学者研究关键。 　　依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶含有黏附贴壁特征, 试验采取贴壁法, 建立一套简单、快速、有效SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、增殖和纯化方法, 观察其生长形态和生物学特征, 验证其向成骨、成软骨、成脂分化能力, 为深入研究骨髓间充质干细胞移植、基因诊疗及组织工程奠定试验基础。 试验方法 1、骨髓间充质干细胞原代分离及传代培养 2、骨髓间充质干细胞形态学观察 3、骨髓间充质干细胞生长曲线绘制 4、骨髓间充质干细胞表面标识物判定 5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化 骨髓间充质干细胞原代分离及传代培养 10%水合氯醛麻醉大鼠, 经颈椎脱臼处死, 大鼠全身浸泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min, 于超净台无菌操作下取其双侧股骨与胫骨, PBS冲洗, 剪去骨两端干骺端, 用10 mL注射器吸收LG-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔, 搜集经细胞筛过滤后细胞悬液, 以1 000 r/min离心5 min。弃上清, 以 1×109 L-1细胞浓度接种于25 cm2塑料培养瓶, 置于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液, 2, 5 d分别半量换液, 7 d全量换液。待培养瓶中细胞分裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL Trypsin-EDTA解离细胞, 当细胞充足离散时, 加入5 mL含血清培养基终止消化, 离心细胞悬液, 1 000 r/min离心5 min。弃上清, 加入含体积分数为10%胎牛血清LG-DMEM培养基, 将重悬细胞悬液以1∶2百分比进行传代。 骨髓间充质干细胞形态学观察 取原代和第8代细胞, 每日用倒置相差显微镜观察其生长形态及特征并摄影统计。取生长良好细胞于含10%二甲基亚砜血清中冻存, 2周后复苏, 锥虫蓝拒染试验检测死亡及存活细胞, 继续于37 ℃, 体积分数为5%CO2培养箱中培养。 骨髓间充质干细胞生长曲线绘制 取第1, 3代细胞, 胰酶消化后计数, 以5×104个/孔接种于96孔板, 每孔加入10 μL CCK-8溶液, 37 ℃, 饱和湿度, 体积分数为5%CO2培养箱孵育2 h后, 用酶联免疫检测仪于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检测第1, 2, 3, 4, 5, 6, 7天同一时间作相同检测。依据吸光度值绘制细胞增殖曲线。 骨髓间充质干细胞表面标识物判定 　　取融合至90%左右生长状态良好第3代骨髓间充质干细胞, 胰蛋白酶消化、室温离心、细胞计数, 调整待测样本细胞数为1×109 L-1, 分装至各PE管中, 依次加入单克隆抗体CD44、CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b, 每管设置同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体)。常温避光孵育40 min, PBS冲洗细胞, 细胞重悬, 经流式细胞仪检测分析。 骨髓间充质干细胞多向诱导分化 取生长良好第3代骨髓间充质干细胞, 以5×107 L-1接种于24孔板, 待细胞贴壁生长融合至70%-80%时, 向各诱导孔中分别加入成骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C-2磷酸钠), 成软骨细胞诱导剂(含地塞米松、转化生长因子β、维生素C), 成脂细胞诱导剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔定时换液, 以未经处理骨髓间充质干细胞培养孔作为对照。 结果 刚接种于培养瓶骨髓细胞大多数悬浮于培养液中, 细胞呈圆形, 大小不一。接种24 h后开始贴壁, 经过更换培养液, 去除悬浮未贴壁细胞, 48 h后贴壁细胞逐步伸展为梭形、多角形、不规则圆形, 排列不规则(图1A)。7 d后, 贴壁细胞显著增多, 以小圆形和梭形细胞为多, 部分细胞排列趋于平行, 部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质干细胞生长较原代细胞快, 以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代, 细胞增殖活力未见显著改变, 关键以大而铺展多形细胞为主(图1D)。