PCR反应模板及缓冲液——PCR反应体系（一） .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR反应模板及缓冲液——PCR反应体系（一） 按照多年来的实践阅历，已提供了一个标准的PCR反应条件。反应体系普通选用50～100／μL体积，其中含有：50mmol／L KCl、10mmol／L Tris—HCl(室温下pH8.4)、1．5mmol／L MgCl2、100μg／mL明胶或牛血清白蛋白(BSA)、两个引物(各0.25μmol／L)、4种底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol／L)、模板DNA(基因组DNA)0.1μg、TaqDNA聚合酶2．5U。 其中模板DNA的用量必需按照其分子量的多少加以调节，普通需要含10 2～10 5bp拷贝的DNA，封上矿物油防止高温反应时液体的挥发，即可举行PCR反应。反应条件普通为94℃变性30s，55℃退火30s，70～72℃延长30～60s，共举行30次左右的循环。一、PCR反应模板模板的量与纯化程度是PCR成败的关键环节之一。大多数用途的PCR对反应模板的纯度要求并不严格，第二，模板用量很低。但因为种种缘由，预备的模板量要求达到一定水平，一方面可削减因为试验操作和试验精确度方面等缘由而引起的扩增失败，同时用于扩增的模板DNA量越多，因为交错污染引起的反应失败的可能性越小。传统的纯化办法通常采纳去垢剂破坏细胞组分、蛋白水解酶消化除去蛋白质，特殊是与DNA结合的组蛋白，最后用有机溶剂去掉蛋白质和细胞膜成分，用乙醇沉淀核酸。此种纯化DNA的办法彻低可以满足PCR反应。通常状况下，可以采纳越发迅速简便的办法，如用高温低渗液体(如水煮沸)溶解细胞制备PCR反应模板均可满足试验的要求。纯化核酸的目的主要在于除去杂质，特殊是除去干扰Taq酶活性的物质；使待扩增的靶序列DNA裸露和浓缩，从而保证有足量的DNA模板启动PCR反应；有利于评价扩增体系的敏捷度，并按照产物对靶DNA举行定量分析。因为食品成分复杂，除含有多种原料组格外，还含有盐、糖、油、色素等食品添加剂，此外，加工过程中的煎、炸、煮、烤等工艺使原料中的DNA会受到不同程度的破坏，因此，食品中转基因成分的检测具有特别性。二、PCR反应的缓冲液PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素，特殊是其中的Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。目前最为常用的缓冲体系为l0～50mmol／L的Tris—HCl(pH8．2～8．3，20℃)，PCR标准缓冲液含有10mmol／L的Tris—HCl(pH8．3)、50mmol／L的KCl、1．5mmol／L的Mg2+、0.1g／L的明胶。在普通的PCR反应中，1．5～2．0μmol／L Mg2+是比较合适的(对应dNTP浓度为200μmol／L左右)。Mg2+过量能增强非特异扩增并影响产率。现在认为限制KCl和明胶的用量值得倡导，尤其是BSA，虽其对酶有一定庇护性，假如质量不好将起相反的作用，建议用法乙酰化的BSA。KCl在50mmol／L时能促进引物退火，大于此浓度时将会抑制聚合酶的活性。有的反应液以氯化铵或醋酸铵中的NH+才代替K+，其浓度为16．6mmol／L。在PCR中用法10～50mmol／L Tris HCl，主要靠其调整pH使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。Tris缓冲液是一种双极化离子缓冲液，pKa为8．3(20℃)，△pKa为一0.021／℃。在反应体系中加入适量(10％)的二甲基亚砜(DMSO)，虽然DMSO对聚合酶活性有一定抑制作用，但它可削减模板二级结构，提高PCR反应特异性。有报道指出甲酰胺或氯化四甲基铵(TMAC)均可提高反应特异性，而对酶活性没有显然影响。标准缓冲液对大多数模板DNA及引物都是适用的，但对某一特定模板和引物的组合，标准缓冲液并不一定就是最佳条件，因此各试验室可在此条件上，按照详细扩增项目举行改进。其中Mg2+浓度对扩增作用的特异性和产量有显然影响。Taq酶是一种Mg2+依靠酶，Mg2+浓度普通为1．5mmol／L左右，Mg2+浓度过低时，酶活力显然降低；过高时，酶可催化非特异性扩增。因为反应体系中的DNA模板、引物和dNTP都可能与Mg2+结合，因此降低了Mg2+的实际浓度。所以建议反应中Mg2+用量起码要比dNTP浓度高O．5～1．0mmol／L。