依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响临床医学.docVIP

依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 5 文2：原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤Caspase3和Caspase9活性的影响 6 1 材料 7 2 方法 8 3 结果 9 4 讨论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响临床医学 文1：依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响临床医学 原发性脑损伤后继发的缺血再灌注损伤成为脑损伤不可逆的主要因素。目前依达拉奉(edaravone)是对脑缺血再灌注损伤中产生的自由基进行清除的有效药物，通过清除自由基及其引发的脂质过氧化抑制脑水肿和迟发性神经细胞死亡，从而有效改善神经缺损体征〔1〕。依达拉奉从根本上改变了脑损伤急性期的治疗策略和神经保护治疗措施。本文拟探讨依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响。 1 材料与方法 动物 选用健康雄性清洁级 SD大鼠 160只,体重 200～280 g,鼠龄 3～4个月,由吉林大学基础医学院动物中心提供。 模型制备与分组 将入选的动物随机分成正常组、假手术组、模型组和治疗组,其中正常组、假手术组各5只大鼠,假手术组给予麻醉及切口暴露。模型组和治疗组又分为缺血 2 h再灌注6、12、24、48、72 h组,每小组各 5只大鼠。在22℃环境温度中实验，予3 %戊巴比妥钠 40 mg/kg腹腔注射麻醉，行颈正中切口，暴露双侧颈总动脉，麻醉减浅后，右侧上无创微动脉夹夹闭30 min，制作大鼠右侧大脑缺血再灌注模型。选用苏醒后行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为模型成功者进行实验。 实验药物与给药方法 实验药物依达拉奉 (必存注射液)由南京先声药业有限公司提供。给药方法为再灌注同时予尾静脉注射给药,之后每隔 12 h注射给药1次,直至动物被处死。给药剂量为 mg/100 g，浓度为 mg/ml。 取材及标本处理 在预定的时间麻醉，开胸，灌注固定，断头取脑。在视交叉后 1 mm及 4 mm处冠状切面切开鼠脑，取中间切块以观察，进行脱水，石蜡包埋。切片分别进行HE染色，细胞凋亡检测，caspase3免疫组化染色。 HE染色 切片常规脱蜡，水化苏木素染色5 min盐酸乙醇分色30 s，伊红复染1～2 min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片。 神经细胞凋亡原位TUNEL检测 (1)石蜡包埋切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，l×TBS(20 mmol/L Tris，;140 mmol/L NaCl)洗涤。(2)用10 mmol/LTrisCl()稀释蛋白酶K(终浓度为20 μg/ml)100 μl，覆盖整个样本，室温孵育20 min以灭活内源性过氧化物酶，l×TBS洗涤。(3)用甲醇1∶10稀释30%H2O2，每个样本用10 μl 30%H2O2与90 μl甲醇混合液室温孵育5 min，1×TBS洗涤。(4)加100 μl用蒸馏水1∶10稀释的10×TdT平衡缓冲液( mol/LTris，; mol/L NaCl; mol/L MgCl2)，室温孵育20 min，吸去液体，加60 μl dUTP标记反应混合液( μl dUTP标记反应混合物; μl TdT酶)，37℃孵育 h，l×TBS洗涤，加100 μl终止液( mol/L EDTA，)，1×TBs冲洗，加100 μl封闭液(4%BSA/PBS)，室温孵育10 min，吸去液体。(5)加100 μl 链卵白素(streptavidin)标记的过氧化物酶溶液，室温孵育30 min，1×TBS洗涤。(6)加100 μl DAB显色液溶于1 ml mol/L TBS ，室温孵育10 min，蒸馏水漂洗，苏木素衬染。梯度酒精常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。(7)阴性对照片用PBS代替TdT酶，其余步骤相同。 caspase3蛋白检测 (1)组织切片常规二甲苯脱腊、梯度酒精脱水。(2)蒸馏水新鲜配制3% H2O2，室温作用10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。(3)微波修复抗原:将切片浸入 mol/L柠檬酸缓冲液(柠檬酸钠 g，柠檬酸 g，加蒸馏水500 ml，)中，微波炉加热至沸腾后10 min，冷却后用 mol/L PBS洗涤2次。(4)甩干PBS液，加l抗37℃孵育60 min， mol/LPBS洗涤3次，每次3 min。(