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（三）转膜缓冲液 39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris碱 0.037% SDS 20% 甲醇 * （四）染色液与脱色液 1．考马斯亮蓝R250染液 100mg考马斯亮蓝R250溶于40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补水至100ml。 2．考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补水至100ml。 3．丽春红S贮存液 2g丽春红S，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加水至100ml。 使用时，将1份上述贮存液加9份去离子水即为丽春红S应用液，使用后应废弃。 * （五）封闭液 5％脱脂奶粉 0.01% 防沫剂A 0.02%叠氮钠 溶于磷酸盐缓冲液（PBS） * （一）样品前处理 细菌一般直接用蛋白上样缓冲液裂解； 真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解液，机械或超声波室温匀浆0.5min～1min。 4℃ 10,000g～13,000g离心5min，取上清 按照每4μl蛋白样品加入1μl 5×蛋白上样缓冲液的比例混合。100℃水浴加热3min～5min，以充分变性蛋白。 冷却到室温，上样到SDS胶加样孔 三、实验方法 * 原理是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂SDS按重量比结合成复合物 使蛋白质复合物所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子所带的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应 蛋白质分子的迁移速率完全取决于分子量的大小，从而达到了分离不同分子量大小蛋白质的目的 （二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 胶有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。 经双丙烯酰胺交联后丙烯酰胺凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，形成的小孔必须能够允许SDS蛋白复合物通过 这些小孔的孔径随双丙烯酰胺、丙烯酰胺比率的增加而变小，比率接近1:20时孔径达到最小值。一般按双丙稀酰胺、丙烯酰胺为1:29配制 * 表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5 57～212 * 1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 （1）安装玻璃板 （2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。 依次混合各成分（见下表） 一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作 * 表2 积层胶、分离胶所需溶液成分的配比 溶液成分（ml） 5%积层胶 不同浓度的分离胶 6% 8% 10% 12% 15% 水 3.4 5.3 4.6 4.0 3.3 2.3 30%丙稀酰胺 0.83 2.0 2.7 3.3 4.0 5.0 1.5mol/L Tris(pH8.8) － 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 1.0mol/L Tris(pH6.8) 0.63 － － － － － 10%SDS 0.05 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 10%过硫酸胺 0.05 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 TEMED 0.005 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 总体积（ml） 5 10 10 10 10 10 * （3）迅速在两板的间隙灌注丙烯酰胺溶液，留出积层胶所需空间（梳子的齿长再加1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液上加一层去离子水。凝胶垂直放置于室温下。 （4）分离胶聚合完全后（约30min），倾斜倒出覆盖的去离子水。 （5）配制5%积层胶。 * （6）在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡。 （7）积层胶聚合完全后（约30min），小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 * 2．上样和电泳 取一定量样品与上样缓冲液混合后，加入上样孔。 将电泳槽与电源连接（正极应接下槽），凝胶上所加的电压为8伏/cm。当上样缓冲液中的染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15伏/cm，继续电泳直至