基因转化方法与转基因植株鉴定全.pptx

基因转化方法与转基因 植株判定;遗传转化主要方法 农杆菌介导遗传转化 基因枪法 电击法 注射法 化学药剂诱导转化 花粉管通道法 ;一、农杆菌介导基因导入(植物细胞) Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium;转化步骤可简单概括为以下方面： 1、获取目标基因。用限制酶切割下目标基因。  2、基因表示载体构建。将目标基因与载体（大多数选取质粒）用DNA连接酶连接起来。  3、将目标基因导入受体细胞。将含目标基因重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。  4、目标基因检测与判定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平判定（这个方法需要导入重组后细胞植物体，详见第五步） 几个方法进行检验（依据要求选取不一样方法）。  5、最终将成功表示细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平判定。;第5页;技术特点： 转化拷贝数低 携带目标基因片段大 整合后外源基因结构变异小 操作简便等优点 该技术已成为转化成功最多一个转化方法;基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法(microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动金属粒子将附着于其表面核酸分子引入受体细胞，外源基因进入受体细胞核后整合到染色体组，然后经过组织培养再生出完整个体(植株)。;程序与方法：;优点： 受体材料起源广泛 靶受体类型广泛 缩短了转基因周期、转基因植株变异率低 及通常含有正常育性 缺点： 转化效率不高 多拷贝插入 费用较高 ;;基因导入方法: 三、电击法 (Gene transfer by electroporation) ;优点： 不受宿主限制 操作简便 对植物细胞不产生毒性 转化效率较高，尤其适于瞬间表示 缺点： 易造成原生质体损伤 存在原生质体再生困难 ;注射法 开始用于动物卵细胞，以后被用于植物。 用显微注射仪把外源DNA 溶液注入到子房或胚囊中，因为子房或胚囊中产生高压力及卵细胞吸收，使外源DNA进入受精卵细胞中，从而取得转基因植株。对于子房大、多胚珠作物，能够说是一个简便可行转化路径。;化学药剂诱导转化 惯用化学诱导剂： 聚乙二醇(PEG) 多聚鸟氨酸(PLO) 聚乙烯醇(PVA) ;优点： 不受宿主范围限制 操作简便 成本底 缺点： 普通只适合用于原生质体转化，而原生质体再生植株并不轻易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等现象。 ;四、花粉管通道法;花粉管通道法 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度约１／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目标基因缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选取得转基因植株。;技术特点： 直接、简便易行; 不需要组织培养继代，从而排除了植株再生障碍； 但转化效率较低； 适合于花器官较大植物。 该方法可用于任何开花植物，将供体总DNA片断，在受体自花授粉后一定时期涂抹于柱头上，使能沿着花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。实际应用时普通切除柱头进行涂抹，这么可降低DNA 进入胚囊距离，提升转化率，但会影响坚固率。 ;转基因植物判定;转基因植物判定;检测拷贝数;Southern blot 制作探针： ----- 依据试剂盒要求确定DNA用量， 普通不超出100ng. ------ 反应结束后对探针最好用层析柱进 行纯化 ; -----不一样植物用于Southern杂交DNA量不一样，普通每泳道拟南芥DNA用量为10-25ug. -----普通用高于酶切需要量DNA10倍酶量，DNA浓度不要过高。注意不一样酶要求反应温度不一样。 -----酶切后取少许样品检测酶切是否完全，假如不完全，可加酶后继续酶切。;;普通用尼龙莫 普通试验室多采取毛细管法 转膜缓冲液普通为10XSSC或SSPE, 转膜时间普通为48hr。用UV确认转膜是否完全。 固定： UV 0.4M NaOH, 80oC烘烤1.5-2小时;二、 Northern blot;-----电泳槽用5%过氧化氢处理2个小时以上，DEPC处理水清洗2次。 -----灭菌、RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理水及1.2克琼脂糖，微波炉加热溶解，60oC水浴上放置15分钟，加入5ml20xMOPS及15ml甲醛溶液，灌胶。与通风橱中进行。; ----RNA加样缓冲液： 35ul 37%甲醛 100ul 甲酰胺 5ul 20XM