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人牙髓干细胞的增殖及分化EPO的影响研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人牙髓干细胞的增殖及分化EPO的影响研究 1 一、资料和方法 2 二、结果 3 三、讨论 4 文2：穿心莲内酯对不同分化胃癌细胞株的体外增殖的影响 5 1 实验材料 6 2 实验方法 7 3 结果 8 三种胃癌细胞系对穿心莲内酯敏感性的比较 见表5,图1 9 4 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 人牙髓干细胞的增殖及分化EPO的影响研究 文1：人牙髓干细胞的增殖及分化EPO的影响研究 促红细胞生成素（erythropoietin，EPO），是一种可以结合并激活红系造血祖细胞表面的EPO受体，从而促进红细胞生成的必须激素。临床重组人EPO主要用于治疗肾性贫血及恶性肿瘤伴发的贫血等多种贫血[1]。除促进红系造血祖细胞增殖分化，近年来报道发现EPO有促进神经再生[2]和保护神经的作用[3]，以及成骨作用[4]。有研究指出EPO可通过多种途径促进MSCs成骨，包括促进VEGF和PCNA的表达[5]。本实验通过研究EPO对体外培养的hDPSCs增殖及分化的作用，以期为EPO应用于牙髓组织再生实现对牙体牙髓病的治疗提供理论依据。 一、资料和方法 1. 主要试剂与仪器：不完全DMEM低糖培养液、PBS缓冲液（江苏凯基生物技术股份有限公司）；胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；CCK-8（日本同仁化学研究所）；碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天）；TRIzolreagent（美国LifeTechnologies）；反转录试剂盒（日本Takara）；引物（金斯瑞生物科技有限公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus);RealtimePCR仪（美国AppliedBiosystems）等。 2. hDPSCs的分离和培养：收集年轻患者无龋正畸减数拔除牙，无菌条件下获取牙髓组织，加入Ⅰ型胶原酶中，37℃消化，离心，弃上清，用培养液吹散组织块；将组织块铺于大皿皿底，加入10ml含20%FBS高糖DMEM培养基；37℃、5%CO2培养，每2～3d换液1次，细胞长至80%汇合度时消化传代。 3. EPO对hDPSCs增殖的影响：取3～5代hDPSCs以3×10[3]细胞/孔接种于96孔板，待细胞贴壁，加入含不同浓度EPO(0、、1、10、20、50U/ml）的DMEM培养基，常规培养1、3、5、7天，加入CCK-8试剂后培养1h，检测各孔450nm吸光度。 4. ALP染色及活性测定：配置成骨诱导基（含1×10-8mol/L地塞米松、100mMβ-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C的DMEM）。取3～5代hDPSCs以5×10[4]细胞/孔接种于24孔板中，实验分为5组：只加成骨诱导基为对照组，成骨诱导液中加1、10、20、50U/mlEPO为实验组。矿化诱导7d和14d后，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，ALP染色1～，蒸馏水洗涤，显微镜观察拍照。成骨诱导7d后，参照碱性磷酸酶试剂盒说明进行处理检测ALP活性，405nm波长下测定吸光度。 5. 茜素红染色：取hDPSCs以1×10[5]细胞/孔接种于6孔板，实验分为对照组，EPO组（1、10、20、50、100U/ml），成骨诱导培养21天后，70%冰乙醇固定10min，PBS洗3次，茜素红室温染色10min，PBS清洗，观察结果。 6. Real-timePCR：取第3～5代hDPSCs以1×10[5]细胞/孔的密度接种于6孔板，实验分为6组：对照组，EPO组（1、10、20、50、100U/ml），培养7d。TRIzol法提取细胞总RNA，参照RT-PCR试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，进行荧光定量Real-timePCR反应，分析目的基因的表达。引物及其序列见表1。 7. 统计学分析：采用GraphPadPrism8软件进行单因素方差分析，组间比较采用Tukey法多重比较，以P表示差异有统计学意义。 表1引物序列 二、结果 1. hDPSCs镜下观察：光镜下见原代细胞从块状组织周边游出，成纤维状并呈细长状的梭形和网状星形（图1A）。第3代细胞形态大致较均一，呈多角形或短梭形（图1B） 2. EPO对hDPSCs增殖能力的影响：CCK-8检测结果显示，细胞加药培养第5天，1、10U/mlEPO可促进hDPSCs的增殖（P），见图2。 3. EPO对hDPSCs分化的影响：ALP染色结果显示hDPSCs成骨诱导培养7d和14d后，10U/ml和20U/mlEPO组染色深于对照组（图3）。20U/mlEPO组在成骨诱导第7d的ALP活性