分析高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA不同（农业综合资料）.docVIP

分析高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA不同（农业综合资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：分析高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA不同 1 1、材料与方法 3 Ⅲumina Hi Seg平台测序 4 2、结果 5 3、讨论 8 文2：应激大鼠下丘脑血管紧张素原mRNA的表达 9 图1略 12 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 15 正文 分析高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA不同（农业综合资料） 文1：分析高通量测序的冷应激大鼠肝脏mRNA不同 中国北方冬春季节气候不稳定，常有温度急剧下降的天气，这种气候严重地影响了动物的正常生活习性及生活规律，使动物产生冷应激。冷应激是北方高寒地区养殖现场中常易出现的问题[1]，当动物处于冷应激状态时，机体会降低酶反应、扩散及膜运输的速率[2]，此时动物原用于供能的能量转为调节机体产热，来维持机体温度不变。研究显示，母体产生冷应激后使子代体质降低，致使后代生长发育迟缓、免疫功能紊乱以及疾病易感性增加[3] 肝脏作为动物体内的消化和能量代谢器官及机体内最大的消化腺，其生理功能极为重要，当动物产生冷应激时，对机体调节有着不可或缺的作用[4]。在冷应激条件下，肝脏可出现脂质过氧化反应增强、酶活性改变、肝糖元分解及糖元异生、免疫细胞活性下降，同时肝内糖原合成途径的主要信号通路被抑制，降低了肝糖原含量，提高了血糖、葡萄糖及脂肪酸的氧化水平，表明冷应激对肝功能有极大的影响，甚至引起损伤[5，6]。因此，在冷应激条件下研究m RNA在大鼠肝脏中的差异表达，对研究冷应激机制及抗冷应激添加剂具有重要作用。 近年来，人们对于探索未知基因的需求愈发凸现，通过传统的基因芯片技术探索未知基因难度和成本极高，通过高通量测序技术不仅可缩短实验的周期，降低实验成本，更是显著提高了生物信息稀少，急需完善数据库的物种的应用价值。通过RT-qPCR或现代的“组学”及RNA测序（RNA-Seq）在内的高通量技术，在m RNA及micRNA水平上定量特定的转录组生物标志物，已广泛应用于分子水平的研究[7]。涂晓丽等[8]研究发现，与核心LINC01018(SRHC）、EHHADH-AS1和F11-AS1高度相关的m RNA SLC2A2、PCK2、EHHADH、F11、FM04及NR1I3在HBV+肝细胞癌发生、发展中具有关键作用。相对于基因芯片测序，高通量测序可挖掘出更多未知基因，并有效地减少实验时间，节约实验成本，提高检测量，为一种更加理想的方法[3]。通过该技术对冷应激大鼠体内m RNA进行分析，相比其他的测序技术能对大鼠体内肝脏的基因组、转录组等其他数据进行更精准更具体的分析[9] 本研究通过高通量测序技术及生物信息学法对冷应激大鼠肝脏基因进行测定及分析，筛选差异表达基因，为深入研究冷应激大鼠肝脏基因m RNA的调控机制奠定基础。 1、材料与方法 实验动物 SPF级雄性SD大鼠12只，12周龄，体重（340±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证：SCXK（京）2014-0006。 主要试剂及仪器 Hai Gene 5 min极速RNA提取试剂盒购自哈尔滨新海基因检测有限公司；反转录试剂盒RR047A、荧光染料SYbr green RR820A及DL2000 DNA maker均购自日本Ta Ka Ra公司；Epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒购自美国Epicentre公司；CFX96型荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；高速微型离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司。 动物分组 大鼠随机分为冷刺激组及常温对照组，每组6只，冷刺激组饲养温度为（4±）℃，相对湿度为（45±）%，冷刺激时间为24 h；常温对照组饲养温度为（24±）℃。 肝脏总RNA提取 剖解采集SD大鼠肝脏样品各 g，使用HaiGene 5 min极速RNA提取试剂盒提取各组大鼠肝脏总RNA。经CFX96型荧光定量PCR仪测定基因表达量，并对经NCBI数据库查询比对的多配体聚糖4(syndecan 4，Sdc4）及白蛋白（albumin，Alb）的引物特异性进行验证。反应条件：95℃预变性30 s;95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共40个循环。熔解曲线的建立：于65～95℃之间进行熔解试验，缓慢升温，每℃为1个循环，每个循环5 s，共60个循环[10]。重复3次。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。 RNA的测序 RNA文库构建 将鉴定合格的样品，采用Epicentre Ribo-ZeroTM试剂盒去除rRNA；应用反转录试剂盒合成cDNA后