发酵工程原理与技术第二章.pptVIP

生长谱法  方法： 营养缺陷型菌株与MM以一定的浓度混合倒在培养皿上，干燥后，在皿底画上若干区域，然后，在正面加上微量的氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等营养物的粉末或结晶（滤纸片法也可）。 培养后，如果某一营养物的周围有微生物的生长圈，说明它就是微生物的营养缺陷型。 返 回 诱变 检出营养缺陷型 淘汰野生型 鉴定营养缺陷型 富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法） 夹层培养法 逐个检出法 影印平板法 生长谱法 营养缺陷型突变株的筛选方法 反馈抑制和反馈阻遏 阻遏蛋白 操纵基因 抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株 结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；末端产物的积累 调节基因或操纵基因突变 产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合，但不发生作用；末端产物的积累 抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选 方法： 末端产物结构类似物筛选； 未突变者死， 突变为抗者生并产菌落 营养缺陷型回复突变株筛选。 活性复，结构改变 目标产物 结构类似物 赖氨酸 S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC) 苏氨酸 ?-氨基-?-羟基戊酸（AHV) 异亮氨酸 乙硫氨酸 精氨酸 D-精氨酸 苯丙氨酸 对氟苯丙氨酸 组成酶和诱导酶 组成酶 微生物有些酶总是适量地存在,它们是不依赖 于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。 诱导酶 适应性酶,是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。 大肠杆菌乳糖操纵子 i基因 P O Lac Z Lac Y lac A 有乳糖时 调节蛋白亚基 调节蛋白 阻遏蛋白 RNA聚合酶 i基因 P O Lac Z Lac Y lac A 诱导物乳糖 无活性的 阻遏蛋白 转录 翻译 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷通透酶 β-半乳糖苷乙酰转移酶 mRNA 没有乳糖时 诱导酶弊端 诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。诱导物有时又比较昂贵。 能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少. 生产成本提高 组成型突变株 突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。 少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。 前 进 i基因 P O Lac Z Lac Y lac A 有乳糖时 调节蛋白亚基 调节蛋白 阻遏蛋白 RNA聚合酶 i基因 P O Lac Z Lac Y lac A 诱导物乳糖 无活性的 阻遏蛋白 转录 翻译 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷通透酶 β-半乳糖苷乙酰转移酶 mRNA 没有乳糖时 筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。 　　①加诱导酶合成抑制物 　　②交替培养法 　　③显色反应法 组成型突变株筛选 组成型突变株筛选 ①加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。 组成型突变株筛选 ②交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。 组成型突变株筛选 ③显色反应法 不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变化）——检出。 如:邻-硝基苯酚半乳糖苷(ONPG)可被β-半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚（ONP） 抗（敏感）性突变株筛选 包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 ①抗生素抗性突变：提高产量； ②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； ③条件抗性突变：如温度，可提高产量； 　　（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型） 抗（敏感）性突变株筛选 ④敏感突变：　　 如：柠檬酸----------异柠檬酸 氟乙酸抑制顺乌头酸酶 氟乙酸敏感突变型 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 　　　　少，柠檬酸积累。 顺乌头酸酶 抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株 在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。 抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。 条件抗性突变 因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。 温度敏感突变常用于提高代谢产物产量 致死 营养缺陷 抗性突变菌株的筛选方法 一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。 噬菌体抗性菌株 耐高温菌株 阶梯性筛选法 梯度平板法 纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药