端粒酶逆转录酶在急性坏死性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用.docx

端粒酶逆转录酶在急性坏死性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用 SAP是由胰腺局部炎症所致，累及全身炎症反应综合征，继而造成多器官功能障碍综合征的临床危重病。“白细胞过度激活学说”是SAP发病的重要机制之一。胰腺组织自身消化释放内源性物质，激活中性粒细胞，使得其凋亡延迟，继而释放大量炎症因子，引发“瀑布”效应，致使SAP患者出现全身炎症反应综合征。传统观点认为，端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)仅在肿瘤细胞、生殖细胞、造血细胞中表达。2008年Lepreux等首次发现TERT在中性粒细胞胞质中表达。近年有研究报道，冠心病、原发性卵巢功能不全患者中性粒细胞TERT水平异常表达，中性粒细胞凋亡延迟，但迄今为止，未见SAP时中性粒细胞TERT表达水平的相关报道。因此，本研究探讨TERE对急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠中性粒细胞凋亡的影响。 材料与方法 一、动物与分组 24只SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(沪)2017-0005。大鼠禁食12 h，自由饮水，按数字表法随机分为正常对照组，ANP 3、6 h组和TERT抑制剂BIBR1532干预组（BIBR1532组），每组6只。ANP组大鼠采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠(1 ml/kg)造模，分别在造模后3、6 h处死，经心脏采血。BIBR1532组大鼠在造模前腹腔注射2 mg/kg TERT抑制剂BIBR1532（美国EMC公司），每周3次，连续2周，于造模3 h后处死，经心脏采血。正常对照组大鼠未经任何处理。取各组大鼠胰腺组织，置10%甲醛溶液中固定。 二、方法 1．外周血中性粒细胞分离：采集的大鼠血样本经1%葡聚糖沉淀红细胞，取上层富含粒细胞的血浆，按1∶1容积加入大鼠淋巴细胞分离液，以1 500r/min离心20 min，离心半径9 cm。通过低渗溶液溶解红细胞，Percoll密度梯度离心法分离中性粒细胞，采用台盼蓝、瑞氏染色检测中性粒细胞存活率和纯度。 2．中性粒细胞TERT mRNA检测：应用荧光定量PCR法检测中性粒细胞的TERT mRNA表达量。TERT正向引物序列为5′-CAGATGCGACCCCTATTC-3′，反向引物序列为5′-TGTAACCGGAGCAAACTC-3′；内参GAPDH正向引物序列为5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，反向引物序列为5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s，40个循环。通过仪器自带软件获取Ct值，以公式2－ΔΔCt计算mRNA相对表达量。 3．中性粒细胞TERT蛋白及凋亡相关蛋白检测：采用蛋白质免疫印迹法检测TERT蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-xL、Bax表达量。抗TERT、Bcl-xL、Bax单克隆抗体购自英国abcam公司，工作浓度均为1∶1 000；辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海碧云天生物技术有限公司，工作浓度为1∶200。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。Image J软件分析各条带灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比为蛋白相对表达量。 4．中性粒细胞凋亡检测：取含2×106/ml中性粒细胞的RPMI1640培养液500μl，均匀接种于24孔板，常规培养16 h后，依次加入2.5 μl Annexin V-FITC 和5.0μl碘化丙啶（PI）溶液，上流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡。 5．血清TNF-α、IL-6检测：收集与分离大鼠外周血血清，ELISA检测试剂盒 （美国eBioScience 公司）检测各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平，按试剂盒说明书操作。 6．胰腺组织病理学检查：取甲醛溶液固定的胰腺组织标本，常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察组织病理改变。 三、统计学处理 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。 结? 果 一、各组大鼠中性粒细胞TERT mRNA及蛋白的表达 分离后的大鼠中性粒细胞瑞氏染色显示细胞核呈杆状或2～5分叶状，符合中性粒细胞特征，纯度95%（图1A）；台盼蓝染色显示极少量细胞呈淡蓝色，中性粒细胞存活率97%（图1B）。 正常对照组、ANP 3 h组、ANP 6 h组、BIBR1532组外周血中性粒细胞TERT mRNA表达量分别为1.03±0.26、3.31±1.07、5.21±0.78、1.95±0.49，TERT蛋白表达量分别0.09±0.03、0.4