重组DNA技术与基因工程.pptVIP

整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 转位因子依赖型的体内重组：P1噬菌体的Cre-loxp系统 Cre Cre 5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3 3 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 loxP 反向重复序列 第六十二页，共九十三页。 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 在很多原核细菌细胞中，染色体DNA链上的两个同源区之间可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。 同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点。 同源序列依赖型的体内重组：基本形式 第六十三页，共九十三页。 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源整合 ori 目的基因 同源区域 标记基因 整合位点 染色体DNA 第六十四页，共九十三页。 ori 目的基因 同源区域 标记基因 交换区域 染色体DNA ori 标记基因 + 整合型异源蛋白的表达 DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源交换 第六十五页，共九十三页。 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。 在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。 第六十六页，共九十三页。 包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。 第三十页，共九十三页。 包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体 法的长处所在。 第三十一页，共九十三页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 C 共价修饰的蛋白质 蛋白质变性复性的动力学原理： C1 C2 Cn C U I 1 I n N X1 X2 Xn X Ag Ag Ag Ag I 有效变复性过程中的中间状态 X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态 N 天然状态的蛋白质 U 变性状态的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质 在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成 为无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人 工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。 第三十二页，共九十三页。 包涵体的溶解与变性： 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键， 在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包 涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清洗剂 促溶剂 成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应； 混合溶剂 极端pH 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化； 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强； 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应。 第三十三页，共九十三页。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（refolding）： 包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 第三十四页，共九十三页。 包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作 包涵体复性操作的方法包括： 分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生 一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大 试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+ 蛋白修饰