酶联免疫吸附试验.pptVIP

具 体 步 骤 包被 封闭 加待测物 加一抗，二抗 ，或抗原等 显色 包 被 用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶联板（聚乙烯微量反应板），每孔100μ。 用保鲜膜包好 ，4℃过夜。 如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好 过夜。 次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。 用PBST洗液，洗4~5次。 每次在洗板机清洗酶联板上震荡2~3min后，在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。 包 被 液 0.05M PH 9.6 碳酸盐缓冲液 Na2CO3 1.59 g ； NaHCO3 2.93g ； 加蒸馏水至1000ml PBST 洗 液 2000ml PBS + 1ml Tween-20 PBS： NaCl 8g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.42g；KH2PO4 0.27g； 加1000ml蒸馏水定容，调PH至7.4 洗 板 机 封 闭 用封闭液封闭，每孔100μ。 室温下，在微量振荡器上，封闭2h。 弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。 用PBST洗液，洗4~5次。（同包被） 用保鲜膜包好，4℃可保存一个月。 酶联免疫吸附试验 简 介 1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者Van Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。 ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。 该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。 酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。 所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。 基 本 原 理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复合物和游离成分。 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。 1，固 相 载 体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。 ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为 8×12的96孔式。 聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。 常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。 2，包 被 抗原或抗体固定到固相载体过程称为包被(coating)。 抗原或抗体蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。 这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。 蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。 当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。 此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特