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丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶活性的测定 一、目的要求 学习果蔬组织中丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶活性的测定原理和方法。 二、基本原理 丙酮酸脱羧酶 （Pyruvate decarboxylase，PDC）是作用于α-酮酸的羧化酶的 2+ 2+ 一种，需要以硫胺素焦磷酸为辅酶，同时需要Mg 和Mn 的参与。PDC 可催化 丙酮酸转化生成乙醛。在NADH 存在的情况下，乙醛可在乙醇脱氢酶 （Alcohol 测 dehydrogenase，ADH）作用下被还原形成乙醇，同时，NADH 因为被氧化形成 + NAD 而减少。已知NADH 在波长340nm 处具有最大光吸收，因此，通过测定 检 反应体系在340nm 处的吸光度值的减小变化，可以测定PDC 和ADH 活性。 三、材料、仪器及试剂 质 （一）材料 冬枣、梨、苹果。 （二）仪器及用具 液 研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、水浴锅、容量瓶 （100mL、1000 mL）、分光光度计、试管。 测 海 （三）试剂 1．100mmol/L、pH 6.5MES （2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid）缓冲液 称取 19.52 gMES 溶于850mL 蒸馏水中，用5.0mol/LNaOH 溶液调节pH 上 检 值至6.5，用水定容至1000mL。 2．提取缓冲液 （含2mmol/LDTT 和4% (w/v)PVPP） 质 称取30.8mgDTT、4 gPVPP，用100mmol/L、pH 6.5MES缓冲液溶解、定 容至100mL。 液 3．5mmol/L 焦磷酸硫胺素 （TPP） 称取23.0mg焦磷酸硫胺素盐酸盐（Thiaminepyrophosphatechloride，TPP）， 用蒸馏水溶解、定容至10mL。4℃保存。 测 海 4．1.6mmol/LNADH 称取11.4mg还原型辅酶I钠（NADH-Na ），用蒸馏水溶解并定容至10mL。 4℃保存。 上 2 检 5．50mmol/L 丙酮酸 称取55mg 丙酮酸钠，用蒸馏水溶解、定容至10mL，保存于冰箱 （4℃）。 质 6．乙醇脱氢酶 （ADH） 用100mmol/L、pH6.5MES缓冲液配制15个酶活单位 （U）的ADH 溶液， 液 4℃保存。 7．80mmol/L 乙醛溶液 海 取1.12mL40%乙醛溶液，用蒸馏水稀释、定容至100mL。 8．50mmol/LM