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超氧化物岐化酶活性测定 一、目的要求 学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。 二、基本原理 超氧化物歧化酶 （Superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物与微生 物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD 和 Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基 （O ），它与CAT、POD等酶协同作用来- 测 2 防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机 体的毒害。 检- 超氧阴离子自由基 （O2 ）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。 SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2 和O2。 质 H2O2 再由CAT进一步催化生成H2O 和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应：   液 22  2 22  2 由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般利用间接方法测定SOD活性。 本实验依据SOD抑制氮蓝四唑 （NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。 海 测 在有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下被还原。被还原的核黄素在有氧条 件下极易再氧化而产生O 。当加入NBT后，在光照条件下O 又可将NBT还原为- - 2 2 蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。 上 检 当加入SOD时，SOD可通过清除O 而抑制了NBT的光还原反应，使蓝色甲- 2 腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈 质 低，反之酶的活性愈高。抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正 相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT光还原反应时 液 所需的酶量作为一个酶活性单位 （U）。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 海 测 苹果、梨、番茄等。 （二）仪器及用具 检 上 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、光照箱 （反 应试管处日光灯照度为4 000LUX）、指形玻璃管、容量瓶 （100mL、200mL、1 000mL）。 质 （三）试剂 1．提取缓冲液： 液 （1）100mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液 母液A （200mmol/LNa HPO 溶液）：称取35.61gNa HPO ·2H O 或53.65g 2 4 2 4 2