植物生物技术概论2.pptxVIP

会计学;基因工程(gene engineering)的概念;理论依据;基因工程的基本过程;5;6;一、 DNA的结构与功能;8;9;Chargaff规则的内容;2.结构;（2）DNA的二级结构;13;14;15;16;17;18;19;DNA分子杂交;双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。 绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。 超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。;;（1）DNA分子能在细胞内复制;24;园艺植物生物工程研究所;DNA的基本功能就是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。;DNA体外重组，首先必须获得重组和能够重组的DNA片段。 如何获得DNA片段呢？;28;29;30;31;（1）限制性核酸内切酶的命名;（2）识别序列;;（3）酶切位点;平末端与黏性末端;37;38;反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成黏性末端，有利于DNA片段的重组。 ;40; 同裂酶（isoschizomers)： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 （CCGG) ，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。;同尾酶（isocaudamer）;三、特异DNA片段的PCR扩增;44;45;PCR技术的反应条件;;园艺植物生物工程研究所;反应初期，目的DNA片段呈指数形式增加；随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期（25个循环）。;1. 双链DNA变性 ;51;52;53;54;55;56;57;58;59;寡核苷酸连杆;有的寡核苷酸连杆超过100个核苷酸，其上有多种限制性内切核酸酶识别序列，不仅可作为连杆，而且被组装在克隆载体上成为多克隆位点(MCS)。这样的连杆被称为多克隆位点核苷酸连杆或简称MCS连杆。 ;五 DNA片段的连接重组;63;64;（1）具互补黏性末端片段之间的连接 连接反应可用E.coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶； 待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。 如果是用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。;;;采用核酸外切酶将黏性末端修饰成平末端； 采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。;人工合成的连杆或衔接头 先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA 片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA 分子。;70;3.DNA重组类型 DNA重组实际上是两种DNA片段的连接，若待连接的两种DNA片段各含有一个以上的基因，这样的DNA重组也称为基因重组。 DNA 重组分为插入重组和置换重组。;（1）插入重组 待重组的外源DNA片段的两端具有相同末端，而接受外源DNA片段的DNA分子用某种限制性内切核酸酶酶切后产生的末端与外源DNA片段的末端相同，并且这种限制性内切核酸酶在此DNA分子上只有一个识别序列。 因此，两者用某种限制性内切核酸酶酶切后连接产生的重组DNA分子，外源DNA片段插入到另一DNA分子之中，因此称为插入重组。;（2）置换重组待 重组的外源DNA片段的两端具有相同末端，对于接受外源DNA片段的DNA分子来说，部分序列已被外源DNA片段置换。;园艺植物生物工程研究所