基因诊断的基本原理与临床意义.pptVIP

Β地中海性贫血基因诊断（PCR-ASO） 已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。 Normal βΑGene Probe——与正常βΑ杂交 Mutation βS Gene Probe——与异常βS杂交 第六十二页，共九十三页。 βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针 第六十三页，共九十三页。 1、Gene 缺失遗传病的诊断 1）α地贫的Gene诊断 α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个α Gene时可得到10kb片段。 BamHI BamHI α2 α1 α2 10 kb 14 kb probe 第六十四页，共九十三页。 以αGene为探针，Southern blot 方法检测 αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4 14kb 10kb 第六十五页，共九十三页。 直接诊断：检测已知致病基因 在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等 2.基因重排\缺失 ：核酸分子探针杂交与PCR 第六十六页，共九十三页。 （1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号 （2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座 直接诊断：检测已知致病基因 第六十七页，共九十三页。 杜氏肌营养不良症的基因诊断 DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。 病因是抗肌萎缩蛋白基因突变所致。Gene 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 个Exon ，cDNA全长13974bp，编码3685 Aa，分子量427kD。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。 第六十八页，共九十三页。 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 1. DNA Marker 2. 阳性对照 3. 孕妇 4. 胎儿 5. 阴性对照 4. 胎儿 5. 阴性对照 采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子 第六十九页，共九十三页。 第三十页，共九十三页。 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将待测分析的PCR扩增产物进行电泳，到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时，DNA双链分开，由于不同DNA片段的碱基组成不同，因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以将相同长度但碱基组成不同的DNA片段分开，从而能检测出基因的突变。 6、采用PCR结合变性梯度凝胶电泳技术 第三十一页，共九十三页。 DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。 如在一般正常的细胞中，基因调控区CPG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态。因此DNA甲基化研究是一热点。 7、甲基化特异性PCR技术 第三十二页，共九十三页。 将DNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（primerⅠ），一对为非甲基化的引物（primerⅡ），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究DNA片段部位的甲基化情况。 甲基化特异性PCR技术（ MS-PCR ） 第三十三页，共九十三页。 第三十四页，共九十三页。 以上