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钩藤UHPLC指纹图谱及化学模式识别研究 2020版《中国药典》收载的钩藤，为茜草科植物钩藤Uncaria?rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.、大叶钩藤Uncaria?macrophylla?Wall.、毛钩藤Uncaria?hirsuta?Havil.、华钩藤Uncaria?sinensis?(Oliv.)Havil.或无柄果钩藤Uncaria?sessilifructus?Roxb.的干燥带钩茎枝[1]。目前医药市场上流通的药用钩藤，主要为Uncaria?rhynchophylla?(Miq.)Miq.ex Havil.钩藤。钩藤具有清热平肝，息风定惊的功效，可用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫、头痛眩晕等，临床上常用于治疗高血压、心律失常、焦虑、癫痫等疾病。钩藤所含化学成分众多，主要含有生物碱类、黄酮类、三萜类等成分，其中生物碱被认为是钩藤降压的主要药效组分。 中药指纹图谱是一种综合的、可量化提供化学成分特征的色谱图。就钩藤药材而言，不少学者已开展了一些有关钩藤指纹图谱的研究。例如Huang等以钩藤碱和异钩藤碱为指标成分，建立了不同产地钩藤的HPLC色谱指纹图谱，Tan等针对钩藤生物碱部位，建立了钩藤的HPLC指纹图谱。这些研究为深入评价钩藤的质量做出了有益的探索，但囿于研究的关注点主要集中于钩藤碱、异钩藤碱等少数生物碱成分，且只采用了单一的相似度评价，未对指纹图谱数据进行更深层次的挖掘与探讨，在准确全面反映钩藤内在质量方面尚有所不足。 为了更客观、全面、高效地评价钩藤药材质量，本实验通过UHPLC建立了30批不同来源钩藤的指纹图谱研究，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”标定了15个共有峰，经对照品比对，鉴定出了绿原酸、异帽柱木菲碱、异钩藤碱、钩藤碱、缝籽嗪甲醚、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱7个共有峰。在指纹图谱相似度评价基础上，将指纹图谱数据与化学计量学方法相结合，应用基于化学计量学的聚类分析(cluster analysis，CA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares analysis，OPLS-DA)等多元统计方法对钩藤药材质量进行分析评价，以筛选和识别钩藤质量差异的标志性化合物，便于为有效控制钩藤的质量提供参考。 1 仪器和材料 1.1 仪器 Thermo Fisher UHPLC 3000超高效液相色谱仪；AX205型十万分之一天平(Mettler Toledo，Switzerland)；KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；3K15型高速离心机(美国Sigma公司)；XW-80A型涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂)；Milli-Q超纯水制备仪；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司，天津，中国)。 1.2 试剂 乙腈、甲醇(色谱纯，购于Fisher公司)；甲酸(色谱级，ROE公司)；超纯水由Milli-Q超纯水仪制备。对照品异帽柱木菲碱(批号：B33640)、异钩藤碱(批号：B21526)、钩藤碱(批号：B20453)、去氢毛钩藤碱(批号：B21025)(上海源叶生物科技有限公司)；缝籽嗪甲醚(批号：DST190705)、毛钩藤碱(批号：DST190617-009)、绿原酸(批号：DST181201-021)(成都德思特生物技术有限公司)；以上对照品纯度均 ≥ 98%。 1.3 材料 30批不同来源的市售钩藤收集于湖南、江西、贵州、广西等地，所有样品经天津中医药大学李天祥教授鉴定，表1为不同来源钩藤的具体信息。 表1 钩藤样品信息Table 1 Information of Uncariae Ramulus Cum Uncis 续表1(Continued Tab.1) 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)，流动相：A相为0.1%甲酸-水，B相为乙腈，梯度洗脱，梯度程序为：0～22 min，5% B→18% B；22～37 min，18% B→25% B；37～47 min，25% B→35% B；47～50 min，35% B→55% B，流速为0.3 mL/min，柱温：30 ℃，进样量为2 μL，检测波长为254 nm。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液制备 精密称定异帽柱木菲碱、异钩藤碱、钩藤碱、缝籽嗪甲醚、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、绿原酸适量，分别加入甲醇制成浓度为1 mg/mL的对照品储备液。精密移取各化合物储备液适量，配制成混合对照品溶液，并置于4 ℃冰箱冷藏备用。 2.2.2 供试品溶液制备