生物化学参考第三节核酸的理化性质9月26日.pptVIP

一、核酸的分子大小 不同的生物的DNA分子的大小形状各有不同，下表列出了某些DNA分子的大小以及构象。 DNA来源 分子量 长度 碱基数 构象 大肠杆菌染色体 2.2*109 1.3 mm 3*106 环状双链 流感嗜血杆菌染色体 8*108 300 μm 1.2*106 双链 支原体PPLO株H-39 4*108 150 μm 6*105 双链 噬菌体T2或T4 1.3*108 50 μm 2*105 线状双链 噬菌体λ 3.3*107 13 μm 0.5*105 线状双链 噬菌体ΦΧ174 1.6*106 0.6 μm --- 环状双链 多瘤病毒 3*106 1.1 μm 4.6*103 环状双链 小鼠线粒体 9.5*106 5 μm 1.4*104 线状双链 果蝇巨染色体 8*1010 4.0 cm 1.2*108 线状双链 人第13对染色体 6.4*1010 3.2 cm 9.6*107 线状双链 二、核酸的溶解度与粘度 核酸都微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。因此在提取核酸时往往用氯仿抽提，乙醇沉淀的方法---实验3动物组织中核酸的提取与鉴定。 DNA溶液粘度极大，RNA分子短于DNA，且无定形，所以溶液粘度小于DNA溶液。 DNA变性，粘度降低，所以可以用粘度作为DNA变性的指标。 三、核酸的酸碱性质 多核苷酸中两个单核苷酸残基之间的磷酸残基解离时具有较低的pK’值，全部解离时呈多阴离子状态。所以可以把核酸看成是多元酸，具有较强的酸性。多阴离子状态的核酸可与金属离子结合成盐。 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（碱基上的氨基），因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基上的氨基是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 四、核酸的紫外吸收 由于核酸的组成成分嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键．有强烈的紫外吸收，所以核酸也有强烈的紫外吸收。最大吸收值在260nm， 而蛋白质的最大吸收值在280nm。 核酸变性时，e(p)值显著升高，此现象称为增色效应(hyperchromic effect)。 在一定条件下，变性核酸可以复性，此时e(p)值又回复至原来水平，这种现象称为减色效应(hypochromic effect)。 所以e(p)值可以作为核酸复性的指标。 实验室常用的技术指标（补） 核酸在260nm和蛋白质在280nm有最大吸收峰，在实验室中应用最多。 可用于定性定量测定核酸和蛋白质，以及判定样品纯度（OD260nm/OD280nm）；纯DNA的OD260nm/OD280nm应为1.8，纯RNA应为2.0。 通常1OD值相当于50ug/ml双螺旋DNA，或40ug/ml单螺旋DNA（或RNA）或20ug/ml多核苷酸。 五、核酸的变性、复性和杂交 (一) 变性 (denaturation) 1. 概念 核酸的变性是指维持核酸空间结构的作用力氢键和碱基堆积力被某些理化因素破坏，使核酸的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能的改变。 核酸变性时，双螺旋结构解开，但并不涉及核苷酸间共价键的断裂，因此变性作用并不引起核酸分子量的降低。多核苷酸链的断裂叫降解，伴随核酸的降解，核酸分子量降低。 2. 引起变性的因素 多种因素可引起变性。如加热、pH值、有机溶剂等。 由温度升高引起的变性称为热变性。酸碱度改变引起的称为酸碱变性。 尿素是测定DNA序列时，所用的聚丙烯酰胺凝胶电泳法中常用的变性剂。甲醛也常用于琼脂糖凝胶电泳，测定RNA的分子大小。 3. 变性导致理化性质改变 增色效应 Tm值 粘度降低 旋光性降低 沉降系数S增加 浮力密度大大增加 DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定程度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。 Tm值 DNA热变性的过程是一种“跃变”过程，即变性作用不是随温度的升高徐徐发生的，而是在一个很狭窄的临界温度范围内突然引起变化并很快完成的。 通常把e(p)值达到最高值的1/2时的温度称为“熔点”或熔解温度(melting temperature)，用Tm表示。 DNA的Tm值一般在70-85℃之间。 (二) 复性 (renaturation) 变性DNA在适当的条件下，可使两条彼此分开的链重新由氢键连接而形成双螺