扬子鳄Bmal1基因的克隆及其在中枢神经系统的表达.pdfVIP

扬子鳄Bmal1 基因的克隆及其在中枢神经系统的表达 摘要 扬子鳄（Alligator sinensis ）为我国特有的珍稀爬行动物，隶属爬行纲鳄目，出现 于中生代，具有重要的生态价值和研究价值。Bmal1为节律基因，与其它节律基因一 起共同调节细胞、组织乃至个体的昼夜节律生理活动。BMAL1广泛分布在多种组织 细胞中，与其它节律分子一起维持细胞内的代谢节律。BMAL1结构的改变可能会对 一些生理行为产生影响，比如受视交叉上核节律钟调控的褪黑素的合成节律。本实验 以胎鳄和初孵扬子鳄为材料，从扬子鳄脑组织提取总RNA并反转录为cDNA ，使用聚 合酶链式反应（PCR ）以Cdna为模板扩增Bmal1基因的编码序列（cds ）并对PCR产物 测序；采用荧光定量PCR （q-PCR ）技术检测不同发育时期扬子鳄脑组织Bmal1基因 表达的相对水平；通过免疫组织化学染色技术定位BMAL1在扬子鳄脑组织中的分布。 本实验的设计旨在增进对扬子鳄神经生理调控机制的认识，为扬子鳄的养殖和保护 提供基础资料，同时丰富以鳄类为代表的爬行动物的昼夜节律生理知识。 扬子鳄BMAL1 由652个氨基酸残基组成，其分子量为71.8KD，PI值为6.33，在结 构上相对保守，与其它脊椎动物一致，含有三个保守结构域，分别为一个HLH结构域 和两个PAS结构域。在扬子鳄个体发育的不同阶段Bmal1基因转录水平具有明显的差 异，从胚胎到幼年期伴随着动物个体的发育，Bmal1基因转录水平逐渐升高。BMAL1 免疫阳性细胞广泛分布在扬子鳄中枢神经系统中，但在不同的细胞中免疫染色程度 存在明显的差异。BMAL1免疫阳性细胞在扬子鳄与哺乳动物的中枢神经系统中的分 布相似，在扬子鳄端脑的皮层、脑室背脊外侧、伏隔核，间脑缰核、背外侧丘脑前核、 背外侧丘脑前核、脑室周围灰质、下丘脑，中脑视顶盖最外四层、延脑内侧纵束、网 状上核，小脑皮质和脊髓的腹角等处免疫阳性细胞染色较深。同时还在端脑和视顶盖 发现了比较明显的BMAL1免疫阳性纤维。 总结上述实验结果我们可以得出以下结论：扬子鳄BMAL1 的结构与表达分布同 哺乳动物相似，并且扬子鳄无节律的褪黑素的分泌与BMAL1蛋白的一级结构无关。 关键词：扬子鳄；Bmal1基因；免疫组织化学；荧光定量PCR I 目 录 英文缩略表 1 1. 文献综述 2 1.1 Bmal1 基因研究进展 2 1.1.1 BMAL1 结构特点 2 1.1.2 BMAL1 调控节律的分子机制 3 1.1.1 Bmal1 基因的表达特点 4 1.1.2 Bmal1 基因的功能 4 1.2 鳄类动物中枢神经系统研究进展 5 1.3 扬子鳄Bmal1 基因的研究意义 7 2. 实验材料和研究方法 8 2.1 材料 8 2.1.1 动物 8 2.1.2 主要试剂与设备 8 2.2 方法 9 2.2.1 组织石蜡包埋 9 2.2.2 免疫组织化学染色 9 2.2.3 总RNA 提取 10 2.2.4 cDNA 的合成 11 2.2.5 PCR 扩增扬子鳄Bmal1 基因的cds 序列 11 2.2.6 q-PCR 检测Bmal1 基因在扬子鳄脑组织的相对表达 12 2.2.7 结果分析 13 3. 实验结果 15 3.1 扬子鳄Bmal1 基因cds 区序列分析 15 3.2