甜菜碱醛脱氢酶的分离和活性测定.pdfVIP

甜菜碱醛脱氢酶的分离和活性测定 一、甜菜碱醛脱氢酶的分离纯化 甜菜碱醛脱氢酶是高等植物中甜菜碱合成过程的关键酶之一。高等植物中纯化得到的此种酶 都是由两个具相同分子量的亚基组成。菠菜中，亚基分子量为63000，等电点pI 为5.65。由于 藜科植物中甜菜碱醛脱氢酶 （BADH）的活性受盐胁迫的诱导，这对于甜菜碱的累积具有重要意 义，故对此酶的研究进展很快。 1.仪器设备 冷冻离心机、透析袋、部分收集器、核酸蛋白检测仪、DEAE-Sepharose 阴离子交换柱、 phenyl-SepharoseCL-4B 柱、羟基磷灰石柱、Mono QHR5/5 高效液相层析仪、ω-amino-hexylgrose 柱和 phenyl-Superose 高效液相层析柱。 2.操作方法 1）蛋白质的提取及硫酸铵沉淀：将新鲜菠菜洗净，吸去表面水分。取0.5～1kg 去中脉的叶 片，按2ml/g 样品的比例加入缓冲液A （100mmol/LTricine-KOH，pH8.5，2mmol/L EDTA， 2mmol/LDTT，0.6mol/L 蔗糖）后用组织捣碎机捣碎，匀浆液经6层纱布过滤，滤液在以10000×g 离心10min，所得上清液再重复离心1次。在收集的上清液中，将加入浓度为1.8～2.0mol/L 的 （